真核细胞表达质粒pCMV4增强hCGβ-C3d3DNA疫苗的表达效率和免疫效力

目的 :比较以pCMV4和pcDNA3为载体的hCGβ C3d3DNA疫苗的表达效率和免疫效力。 方法 :分别构建pcD NA3 hCGβ C3d3、pCMV4 hCGβ C3d3真核细胞表达质粒 ,并转染真核细胞瞬时表达系统COS 7细胞 ,以分析体外表达效率。抽提与纯化pcDNA3、pcDNA3 hCGβ C3d3、pCMV4 hCGβ C3d3质粒。对 6周龄BLAB C小鼠行DNA免疫。于末次免疫后 6周采血 ,用间接ELISA分析实验动物外周血抗hCGβ抗体效价。 结果 :对COS 7体外表达效率分析 ,由pCMV4介导的hCGβ C3d3表达效率明显高于pcDNA3。动物DNA免疫结果 ,pCMV4 hCGβ C3d3刺激动物机体产生的免疫应答强度及免疫效果显著高于pcDNA3 hCGβ C3d3。 结论 :pCMV4真核表达质粒hCGβ C3d3体外表达效率及动物DNA免疫效力均显著高于pcDNA3真核表达质粒。

phCMV1和pcDNA3表达人绒毛膜促性腺激素β-C3d3融合蛋白的表达效率比较

目的 比较真核表达载体 phCMV1和pcDNA3在中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞中表达人绒毛膜促性腺激素 β(hCGβ) C3d3融合蛋白的表达效率 ,以获得hCGβ C3d3融合蛋白的高效表达。 方法 利用高效真核表达载体 phCMV1,构建带有 6个组氨酸纯化标签的融合蛋白表达质粒phCMV1 6His hCGβ C3d3;脂质体法介导phCMV1 6His hCGβ C3d3和pcDNA3 hCGβ C3d3转染CHO细胞 ,G4 18(80 0 μg/ml)筛选抗性克隆 ,G4 18(30 0 μg/ml)维持培养、扩增 ,待阳性克隆 95 % 汇片时换用无血清培养基培养。放射免疫法检测hCGβ表达量 ,Westernblot鉴定表达产物 ,Raji细胞免疫化学染色法鉴定hCGβ与C3d分子的成功融合。反复冻存和复苏高效表达hCGβ C3d3融合蛋白的阳性克隆 ,比较表达效率的变化。用镍柱和凝胶过滤层析纯化表达产物。 结果 酶切鉴定及测序证实 phCMV1 6His hCGβ C3d3构建正确 ,并成功地在CHO细胞中获得了 6His hCGβ C3d3融合蛋白的表达。无血清培液中 2 4、4 8、72h融合蛋白的表达量分别为 4 96、5 2 7、6 33mIU/ml/ 1× 10 6细胞 (以hCGβ含量计算 ) ,phCMV1比 pcDNA3载体的表达效率高 1.4倍。 3次冻存和复苏高效表达hCGβ C3d3融合蛋白的阳性克隆 ,表达效率无明显变化。表达产物经纯化后获得了所需的hCGβ C3d3?

hCGβ-C3d3融合蛋白在乳酸杆菌的表达及鉴定

目的探讨融合基因人绒毛膜促性腺激素(hCG)-βC3d3在干酪乳酸杆菌有效表达,为研究携hCG-βC3d3融合基因的乳酸杆菌直接黏膜免疫奠定基础。方法用分子生物学技术构建质粒pIlac.hCG-βC3d3,电穿孔转化干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)CECT 5276,挑选转化后的耐药菌落,在含红霉素的MRS培养基中培养,0.5%乳糖诱导后,在不同时间取上清,化学发光法检测hCGβ,免疫细胞化学鉴定融合蛋白。结果经测序证实目的基因构建正确。免疫化学发光测定显示,转化成功的重组干酪乳酸杆菌在乳糖的诱导下可分泌hCGβ。免疫细胞化学鉴定显示hCGβ与C3d3融合成功。结论实现了重组乳酸杆菌Lb.hCG-βC3d3分泌性表达融合蛋白hCG-βC3d3。

ACTN3-C1747T、ACE-I/D基因多态性在运动员选才中的应用研究

目的探讨ACTN3-C1747T、ACE-I/D基因多态性在爆发力、耐力型运动员选才中应用的科学性。方法提取30名中国汉族中超联赛足球运动员全血DAN,应用基因测序或琼脂糖凝胶电泳法解析ACTN3-C1747T、ACE-I/D多态位点,χ2检验与60名普通人的对照组进行分析。结果ACTN3-C1747T、ACE-I/D多态位点的基因型分布经χ2检验符合H-W平衡(P>0.05)。运动员组与对照组ACTN3-C1747T多态位点的基因型分布差异具有统计学意义(P<0.05),等位基因分布差异也具有显著统计学意义(P<0.05),短跑运动成绩与基因型显著相关。ACE-I/D多态位点的基因型分布具有变化趋势,长跑运动成绩与基因型有一定的相关性,但不显著。结论我国汉族中超联赛足球运动员的ACTN3-C1747T多态位点的CC基因型和优秀的爆发力素质显著相关,可以作为中国汉族爆发力型运动员的选才分子标记;ACE-(I/D)多态位点的Ⅱ基因型与优秀的耐力素质有一定的相关性,可以作为中国汉族耐力型运动员选才分子标记的参考因子。

hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白在CHO细胞中的分泌性表达、鉴定与纯化

目的 :构建带有 6个组氨酸纯化标签的hCGβ和hCGβ C3d3融合蛋白的分泌型真核表达质粒 ,在CHO细胞中获得具有生物学活性的重组蛋白的高效表达。方法 :利用高效真核表达载体phCMV1,构建phCMV1 6His hCGβ和phCMV1 6His hCGβ C3d3,脂质体法转染CHO细胞 ,G4 18(80 0 μg ml)筛选抗性克隆。放射免疫法检测抗性克隆培液中hCGβ表达量 ,Westernblotting和Raji细胞免疫化学法鉴定hCGβ C3d3融合蛋白。用镍柱和凝胶过滤层析纯化表达产物。 结果 :酶切及测序结果显示 ,phCMV1 6His hCGβ及phCMV1 6His hCGβ C3d3构建正确。在CHO细胞中成功地获得了hCGβ和hCGβ C3d3融合蛋白的高效表达 ,phCMV1载体的表达效率是pcDNA3的 1 6倍。表达产物经纯化后得到了所需的hCGβ和hCGβ C3d3融合蛋白。 结论 :hCGβ和hCGβ C3d3融合蛋白在CHO细胞的高效表达为下一步比较hCGβ抗原及hCGβ

pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体构建与验证

目的构建抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)与激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体,并在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中验证。方法设计特定的moesin^(T558A)、moesin^(T558D)基因突变引物,以pcDNA3/HA-moesin为模板,采用逆向PCR技术进行体外定点突变,以丙氨酸、天冬氨酸取代苏氨酸,获得抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体并测序。体外培养HUVECs,随机分为对照1组、pcDNA3/HA空载体组、pcDNA3/HA-moesin组以及对照2组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组、pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组,pcDNA3/HA空载体组、pcDNA3/HA-moesin组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组、pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组分别转染pcDNA3/HA空载体、pcDNA3/HA-moesin、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)、pcDNA3/HA-moesin^(T558D),对照1组与对照2组不予转染。转染24 h,收集细胞,采用实时荧光定量PCR法检测moesin mRNA表达,采用Western blotting法和免疫荧光法检测moesin蛋白表达。结果经测序,目的基因moesin^(T558A)、moesin^(T558D)序列完全正确,第558位苏氨酸分别突变为丙氨酸、天冬氨酸,抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体构建成功。pcDNA3/HA-moesin组moesin mRNA相对表达量显著高于对照1组和pcDNA3/HA空载体组(t分别为16.688、16.649,P均<0.05),而pcDNA3/HA空载体组与对照1组比较差异无统计学意义(t=1.925,P>0.05)。pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组moesin mRNA相对表达量均显著高于对照2组(t分别为13.809、9.260,P均<0.05),pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组与pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组比较差异无统计学意义(t=2.364,P>0.05)。Western blotting结果显示,pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组和pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组均能观察到HA-moesin蛋白表达,而对照1组未观察到HA-moesin蛋白表达。免疫荧光结果显示,pcDNA3/HA-moesin组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组和pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组均能观察到HA-moesin荧光,而对照2组未观察到HA-moesin荧光。结论成功构建了抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体;经验证,这两种基因突变体均能促进moesin表达。

自身抗-C_(3d)导致交叉配血困难2例

1病例简介患者1，女，18岁。因乏力，胸闷，憋气，偶有双膝关节酸胀不适，大便颜色发黑来本院就诊。血常规示：Hb 27g/L，RBC 0．68×10^9/L，临床确诊为系统性红斑狼疮。患者2，女，67岁，因乏力，咳嗽进行性加重伴发热，恶心，呕吐来本院就诊，血常规示：Hb 46g/L。RBC1．18×10^9/L，临床确诊自身免疫性溶贫（温抗体型）。两患者均自述无输血史。输血前常规采用聚凝胺法交叉配血时发现主、次侧均凝集，

脐动脉血流S/D值联合孕妇血清CX3CL1 HIF-1α对胎儿窘迫的诊断价值

目的探讨脐动脉血流收缩期末最大血流速度/舒张期末最大血流速度(S/D)、血清趋化因子C-X3-C配体1(CX3CL1)、血清缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对胎儿窘迫(FD)的诊断价值。方法选取2020年5月至2022年5月在青岛市妇女儿童医院妇产科分娩且出现FD的128例孕妇为研究对象(FD组),根据新生儿Apgar评分将FD孕妇分为轻度窘迫组74例和重度窘迫组54例,另取同期在本院定期产检并分娩的健康且未出现FD的孕妇78例为正常组;超声检测FD孕妇脐动脉血流S/D值;ELISA法检测FD孕妇血清CX3CL1、HIF-1α水平;Pearson法分析FD孕妇血清CX3CL1、HIF-1α水平与脐动脉血流S/D值的相关性;受试者工作特征(ROC)曲线分析血清CX3CL1、HIF-1α水平及脐动脉血流S/D值对胎儿重度窘迫的诊断价值。结果FD组孕妇脐动脉血流阻力指数(RI)、搏动指数(PI)、S/D值、血清CX3CL1及HIF-1α水平均显著高于正常组(P<0.05),重度窘迫组孕妇RI值、PI值、S/D值、血清CX3CL1及HIF-1α水平均高于轻度窘迫组(P<0.05)。FD组血清CX3CL1、HIF-1α与脐动脉血流S/D值均呈正相关(r=0.531、0.489,P<0.05)。脐动脉血流S/D值、血清CX3CL1、HIF-1α以及3项联合诊断胎儿重度窘迫的AUC分别为0.870、0.802、0.731、0.941,联合诊断的灵敏度为87.04%,特异度为90.54%,3项联合优于脐动脉血流S/D值、血清CX3CL1、HIF-1α各自单独诊断(Z3项联合-S/D=2.775、Z3项联合-CX3CL1=3.998、Z3项联合-HIF-1α=4.925,P均<0.05)。结论FD孕妇脐动脉血流S/D值、血清CX3CL1、HIF-1α水平均上升,且血清CX3CL1、HIF-1α水平与脐动脉血流S/D值均呈正相关,3项联合对诊断胎儿重度窘迫有更高的价值。

D3-C42X2(X=H,F,Cl)的密度泛函理论研究

应用密度泛函理论B3LYP在6-31G(d)水平上对D3-C42的衍生物D3-C42X2(X=H,F,Cl)进行几何优化,从总能量、反应热以及前线分子轨道HOMO-LUMO能级角度判断,D3-C42X2(X=H,F,Cl)在热力学上是稳定的,相同衍生位置的C—F键的强度最大,C—Cl键比C—H键稍强。经过振动频率计算验证衍生物在势能面上的属性后,进一步明确1-4加成的异构体D3-C42X2-2-9(X=H,F,Cl)在所研究的分子中较为稳定。

hCGβ与鼠补体片段C3d的连接及其在真核细胞中的表达

目的:构建含新型分子佐剂C3d的hCGβ真核细胞表达质粒,以提高hCGβ的免疫原性。方法:用pcr方法在hCGβ cDNA3’端引入BamHI位点,然后利用酶切位点的互补性,与C3d3 cDNA连接,构建了pBS-hCGβ-C3d3质粒,最后插入真核细胞表达质粒pcDNA3的CMV启动子下游,以产生pcDNA3-hCGβ-C3d3。将此融合质粒转染瞬时表达系统 COS-7细胞表达相应产物。其无血清培养上清液用免疫亲和层析法纯化重组蛋白。Raji细胞免疫细胞化学技术鉴定表达产物准确性。结果:真核细胞瞬时表达系统 COS-7细胞经转染了pcDNA3-hCGβ-C3d3质粒后,可分泌hCGβ重组蛋白。1.0×105个 COS-7细胞转染了pcDNA3-hCGβ-C3d3质粒,经72h培养后,可产生152ng的hCGβ重组蛋白,且表达量随时间延长而增高。在有血清培养基中的分泌量明显高于无血清培养基。同时,用Raji细胞免疫细胞化学分析表达产物显示,纯化的表达产物既有C3d结合受体活性,亦有hCGβ抗原性。结论:利用新型分子佐剂C3d与hCGβ的连接,构建了pc-DNA3-hCGβ-C3d3真核细胞表达质粒,为提高hCGDNA免疫避孕疫苗的免疫原性及抗生育作用奠定了基础。

D3-C32X2(X=H,Cl)的电子结构、核磁共振及振动光谱理论研究

本研究应用密度泛函理论在B3LYP/6-31G(d)水平上对D3-C32的二元氢、氯衍生化异构体进行几何优化。对优化结构的相对能量和前线轨道能级差的分析表明,D3-C32X2(X=H,Cl)在热力学上是稳定的。通过对衍生物的碳、氢以及氯的核磁共振以及振动频率计算,验证了衍生物D3-C32X2在势能面上的属性;结合D3-C32的表面静电势及结构特点发现,最易收到加成的位置是三个五元环共用的C 10顶点,从而明确了1-8加成的异构体D3-C32X2(X=H,Cl)在所研究的分子中最为稳定。

D3-C32F2的稳定性和振动光谱的理论研究

应用密度泛函理论在B3LYP/6-31G(d)水平上对D3-C32的二元氟化衍生异构体进行几何优化,对优化结构的反应热和前线轨道能级差的分析表明,D3-C32F2在热力学上是稳定的,最稳定的异构体是1-8加成的D3-C32F2-1-32,振动频率计算发现,对称性会影响结构的最大振动频率及强度,衍生化位置对称性越高,振动强度越大。

C3d3-hCGβ融合蛋白免疫BALB/c小鼠增强抗hCG-β T_H2型体液免疫效应

目的 通过分子佐剂C3d3增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性并实现免疫效应向TH2型体液免疫偏倚。方法 在CHO细胞中表达、纯化hCGβ、C3d3和hCGβ C3d3融合蛋白。分别用hCGβ C3d3融合蛋白、单用hCGβ、hCGβ联合C3d3和hCGβ加用弗氏完全佐剂免疫BALB c小鼠 ,共免疫 2次 ,间隔 4周。ELISA测定血清中抗hCGβ抗体滴度。末次免疫后 3周处死小鼠制备单个脾细胞悬液 ,体外用hCG刺激培养 4 8h ,ELISA检测上清中TH1型 (IFN γ、IL 2 )和TH2型 (IL 4、IL 10 )细胞因子分泌水平。结果 C3d3使hCGβ的免疫原性增强了 1995倍 ,C3d3的佐剂能力是弗氏完全佐剂的 10倍 (初次免疫 )～ 32倍 (再次免疫 )。借助C3d3分子佐剂 ,hCGβ C3d3融合蛋白可产生很明显的TH2型体液免疫优势效应。结论 分子佐剂C3d3可以大幅增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性 ,使免疫效应向TH2型体液免疫偏倚。

补体C_3d对抗人球蛋白交叉配血的影响及处理分析

目的:分析临床患者交叉配血试验中使用不同抗人球蛋白试剂结果不一致的因素,为临床出现抗人球蛋白法疑难配血提供借鉴及处理对策。方法:采用广谱及单特异性抗人球蛋白检测卡对患者进行血清学检测,并应用不同抗人球蛋白试剂进行试管法复查,其中交叉配血试验将患者血清56℃30min处理后再进行卡式法及试管法验证。结果:2例患者样本均为使用单特异性抗-IgG试剂配血相合,使用广谱及抗-C_3d试剂配血不合。且患者血清经56℃30min处理后使用不同试剂均配血相合。结论:结合患者临床病例资料,证实2例样本均是由血清中补体C_3d成分对使用广谱试剂的抗人球蛋白配血试验造成干扰,可给予单特异性抗-IgG试剂下配血相合血液输注,以改善其贫血症状。

^(18)F-FMTP的放射化学合成

8 甲氧基 3 (4 氟苄基) 1,2,3,4 四氢苯并吡喃[3,4 c]吡啶 5 酮(FMTP)作为选择性多巴胺D4受体拮抗剂显示出高的亲和性和选择性(与D4受体的结合常数Ki=4.3nmol/L,与D2受体的结合常数Ki>5800nmol/L)。文章采用三氟甲基磺酸 4 三甲基铵苯甲醛为前体,完成了18F标记的亲核取代反应,用18F标记的中间体同8 甲氧基 1,2,3,4 四氢苯并吡喃[3,4 c]吡啶 5 酮完成胺烷基化反应,得到目标产物8 甲氧基 3 (4 [18F]氟苄基) 1,2,3,4 四氢苯并吡喃[3,4 c]吡啶 5 酮(18F FMTP)。产物的总合成时间(包括高效液相纯化)为110min,放化产率为19.5%,放化纯度大于98%,比活度高于37GBq/μmol。