TCF4／pcDNA3．0表达载体的构建及其在毛乳头细胞中的表达

目的构建TCF4/pcDNA3.0表达载体,为深入研究T细胞因子4(T cell factor4,TCF4)基因在毛乳头细胞生物学功能调控中的作用和机制奠定基础。方法从凝集性生长毛乳头细胞中提取总RNA,RT-PCR获得带有酶切位点的TCF4基因,亚克隆入pCDNA3.0载体中,并通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确。稳定转染到毛乳头细胞中进行表达,检测稳定转染前后TCF4表达的变化。结果从人毛囊毛乳头细胞中获得TCF4基因克隆;成功构建了真核表达载体。经过稳定转染在毛乳头细胞中上调了TCF4基因mRNA和蛋白水平表达,促进了毛乳头细胞的增殖和外分泌功能。结论TCF4/pcDNA3.0表达载体能在真核细胞中表达。TCF4基因可以促进毛乳头细胞增殖。

带Flag标签的Sirt4真核表达载体的构建及功能验证

目的构建带Flag标签pcDNA3.0载体的Sirt4真核表达载体,同时验证该基因与肝癌细胞HepG2生长之间的关系。方法以人卵巢文库为模板,采用PCR技术扩增出Sirt4的CDS区编码序列,将PCR产物插入到带Flag标签的pcDNA3.0载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞提取质粒,测序正确后将pcDNA3.0-Flag和pcDNA3.0-Flag-Sirt4分别转染肝癌细胞HepG2,Western印迹实验鉴定目的基因蛋白表达,CCK-8法、克隆形成实验测定其对肝癌细胞HepG2生长的影响,Transwell证明Sirt4对肝癌细胞HepG2体外侵袭能力的影响。结果双酶切结果显示,pcDNA3.0-Flag-Sirt4真核表达载体构建成功;Western印迹实验验证该基因蛋白成功表达;CCK-8法和克隆形成实验证明过表达Sirt4基因抑制HepG2细胞增殖,Transwell证明过表达Sirt4明显抑制HepG2细胞体外侵袭能力。结论pcDNA3.0-Flag-Sirt4真核表达载体构建成功,过表达Sirt4基因可抑制肝癌细胞增殖及体外侵袭能力,为进一步研究Sirt4在肝癌中的发生与发展奠定了基础。