pcDNA3.0-PTEN质粒转染15dPGJ2对乳腺癌MCF-7细胞体外培养的影响

目的：探讨15dPGJ2和PTEN质粒转染对人乳腺癌细胞株MCF-7体外培养的抑制作用，为临床靶向和基因治疗提供基础试验依据。方法：取生长良好的乳腺癌MCF-7细胞株，按5．0×10^6／L接种96孔板，按析因试验设置试验组，分别给予过氧化物酶体增殖物受体d然激动剂15dPGJ2，用野生型抑癌基因PTEN真核表达载体pcDNA3．0-PTEN质粒转染（脂质体转染法）MCF-7乳腺癌细胞株。采用MTT比色法观察15dPGJ2和野生型PTEN质粒转染对体外培养的MCF-7细胞系生长的抑制作用；用倒置光学显微镜观察MCF-7细胞用药前后的形态学变化；取生长良好对数生长期的MCF-7乳腺癌细胞株，调整细胞浓度至2．0×10^7／L接种于6孔板，设置3个复孔。连续培养3d；待细胞生长超过40％时，用15dPGJ240μmol／L，pcDNA3．0-PTEN质粒2μg／ml转染后连续培养3d常规消化收集细胞，离心，70％酒精固定，应用流式细胞仪检测凋亡细胞和细胞周期变化。结杲：15dPGJ2和PTEN质粒转染能有效的抑制体外培养的乳腺癌细胞株MCF-7的生长（P〈0．05），两者联合使用抑制效果更好（P〈0．05）。pcDNA3．0-PTEN质粒转染、15dPGJ240／μmol／L和两者联合干预在MCF-7乳腺癌细胞株连续72h时即达到有效抑制率，联合处理组处理MCF-7乳腺癌细胞株细胞生长抑制率最大（P〈0．05）。pcDNA3．0-PTEN质粒转染72h能将60．6％的MCF-7乳腺癌细胞阻滞在G0-1期（DNA合成前期）周期阻滞效果最为明显（P〈0．05）。与对照组相比pcDNA3．0-PTEN质粒转染、15d-PGJ2干预及联合用药均不能有效的诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡（P〈0．05））。联合用药细胞凋亡率低于单用15d-PGJ2（P〈0．05），pcDNA3．0-PTEN质粒转染可降低MCF-7乳腺癌细胞的凋亡率（P〈0．05）。结论：体外培养抑制试验证明pcDNA3．0-PTEN质粒转染、15dPGJ2 40μmol／L能有效的抑制乳腺癌细胞株MCF-7的生长，pcDNA3．0-PTEN质粒转染能抑制MCF-7乳腺癌细胞的恶性表型，pcDNA3．0-PTEN质粒转染抑制MCF-7乳腺癌生长的机制是周期阻滞，联合15d-PGJ2不增加周期阻滞作用。

野生型抑癌基因PTEN真核表达载体的鉴定及其在COS-7细胞株表达产物的鉴定

目的:电泳并真核细胞鉴定pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒。方法:将含有pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒的EcoliJM109细胞挑少许于LB液体培养基上,振荡过夜,离心,碱裂解法裂解细菌,参照UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒操作步骤抽提质粒,电泳鉴定,将获得的pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒采用脂质体转染法转入COS-7细胞株,传代培养细胞株,West-Blot鉴定PTEN蛋白质的表达。结果:实验得到的pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒大小约为6.0kb,质粒浓度为0.080μg/μl。该质粒目的基因在COS-7细胞株表达产物经West-Blot鉴定证实为目的基因表达产物。结论:pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒内含有所需目的基因,该真核表达系统能在真核细胞株COS-7表达所需目的基因产物,可以应用该质粒对PTEN基因缺失或杂合性缺失的肿瘤细胞进行试验性治疗。

兔抗人重组生长激素rhGH多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备抗人生长激素(growth hormone,GH)的多克隆抗体并鉴定其性能。方法真核细胞表达质粒pcDNA3.0-GHcDNA免疫家兔,制备rhGH多克隆抗体;ELISA法检测抗体效价。亲和层析法纯化后,进行Western blot、免疫组织化学和激光共聚焦显微镜检测,鉴定抗体的特异性与适用范围。结果得到兔抗人重组人生长激素rhGH多克隆抗体,效价达1:40000。纯化后的抗体可特异识别超表达的hGH和人内源性GH,可用于免疫组织化学实验、Western blot及激光共聚焦。结论用质粒免疫家兔制备的抗GH抗体具有较高的效价以及特异性,为hGH的功能性研究提供了有力的支持。

带Flag标签的Sirt4真核表达载体的构建及功能验证

目的构建带Flag标签pcDNA3.0载体的Sirt4真核表达载体,同时验证该基因与肝癌细胞HepG2生长之间的关系。方法以人卵巢文库为模板,采用PCR技术扩增出Sirt4的CDS区编码序列,将PCR产物插入到带Flag标签的pcDNA3.0载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞提取质粒,测序正确后将pcDNA3.0-Flag和pcDNA3.0-Flag-Sirt4分别转染肝癌细胞HepG2,Western印迹实验鉴定目的基因蛋白表达,CCK-8法、克隆形成实验测定其对肝癌细胞HepG2生长的影响,Transwell证明Sirt4对肝癌细胞HepG2体外侵袭能力的影响。结果双酶切结果显示,pcDNA3.0-Flag-Sirt4真核表达载体构建成功;Western印迹实验验证该基因蛋白成功表达;CCK-8法和克隆形成实验证明过表达Sirt4基因抑制HepG2细胞增殖,Transwell证明过表达Sirt4明显抑制HepG2细胞体外侵袭能力。结论pcDNA3.0-Flag-Sirt4真核表达载体构建成功,过表达Sirt4基因可抑制肝癌细胞增殖及体外侵袭能力,为进一步研究Sirt4在肝癌中的发生与发展奠定了基础。