pcDNA3.1(+)TPA构建及其在人皮肤成纤维细胞的表达活性

为建立TPA基因治疗缺血性心脏疾病及防止血管再狭窄的新方法。构建真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA ,并采用脂质体法将其转入体外培养的人皮肤成纤维细胞 ,并观察外源性TPA表达情况。结果发现 :真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA在人皮肤成纤维细胞中获有效表达 ,酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为 6 4 7.8ng/(10 6细胞·2 4h) ,未转pcDNA3.1(+)TPA的人皮肤成纤维细胞测得为 19.2ng/ (10 6细胞·2 4h) ;发色底物法测得外源性TPA活性为 12 5.0U/ (10 6细胞·2 4h) ,未转pcDNA3.1(+)TPA的人皮肤成纤维细胞测得为 5.8U/ (10 6细胞·2 4h)。提示 :pcDNA3.1(+)TPA转入人皮肤成纤维细胞后 ,外源性TPA基因获有效表达 。

日本血吸虫pcDNA3.1(+)/MLP核酸疫苗的构建及其对家兔保护性免疫作用的研究

目的 体外扩增日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白抗原的部分基因序列 ,构建日本血吸虫pcDNA3 1(+) /MLP核酸疫苗 (SJP) ,免疫新西兰家兔 ,观察它在肌肉组织中的表达、及其对家兔的保护性免疫作用。方法 分子克隆常规操作构建SJP疫苗 ,免疫家兔 ,家兔肌肉组织体外扩增查MLP基因 ,并通过免疫组化观察重组蛋白在局部肌组织中的表达 ;做血清抗体及细胞因子分析 ,计算减虫率及减卵率。结果 经酶切、PCR及测序鉴定表明所构建的SJP中含有目的基因序列 ;免疫家兔 8周后可以在免疫家兔肌肉中检测到MLP基因 ,免疫组化结果阳性 ;可诱导IgA、IgG1及INF -γ变化 ,减虫率为2 4 10 % ,减卵率为 2 8 10 %。结论 成功地构建了含目的基因的核酸疫苗SJP ,SJP免疫家兔后 ,肌组织有重组蛋白的表达 ,并可产生一定的免疫保护性作用。

pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Gro α真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα. 方法:据GeneBank中大鼠MCP-1和GroαcDNA序列设计并合成引物,提取急性胰腺炎模型大鼠总RNA,RT-PCR 扩增,并将扩增产物TA克隆至pGEM-T easy载体,然后分别双酶切pGEM-MCP-1和pGEM-Groα回收目的片段再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+). 结果:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Gro α真核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定,证实其构建成功. 结论:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建成功,为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备急性胰腺炎pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-GroαDNA疫苗奠定了基础.

子宫内膜中TLR4的定位及pcDNA3.1-TLR4载体的构建

试验旨在研究TLR4(Toll like receptor4)蛋白在子宫内膜组织中具体的分布与表达,从而构建TLR4真核表达载体,为TLR4在细胞水平上的功能研究提供一种技术手段.选择早期妊娠绵羊(9d、13d、17d、21d、25d)子宫组织,采用免疫组织化学和细胞免疫学抗体着色法检测各阶段子宫组织中TLR4蛋白的分布与表达,确定受体蛋白的表达部位.同时将构建的pcDNA3.1-TLR4质粒转染到确定的受体细胞,检测TLR4蛋白的表达水平.结果表明:TLR4蛋白在子宫内膜各部位均有表达,呈一定的动态时空模式,且第17d胚胎附植后主要表达于内膜基质细胞;重组质粒转染到基质细胞后,TLR4蛋白的表达水平明显增强.此研究成功构建pcDNA3.1-TLR4表达载体,为TLR4在生殖细胞免疫学功能的研究奠定了一定的理论基础.

pcDNA3.1(+)-NPM1真核表达质粒构建

目的构建pc DNA3.1(+)-NPM1真核表达质粒,体外转染人膀胱移行细胞癌pumc-91细胞并观察其表达情况。方法设计引物,采用PCR扩增核仁磷蛋白1(Nucleophosmin,npm1)基因编码序列;运用基因重组方法对其进行双酶切,插入pc DNA3.1(+)载体,经菌液PCR、测序对重组质粒进行鉴定。将成功构建的质粒经脂质体介导转染至pumc-91细胞,Western blot验证蛋白表达情况。结果经菌液PCR、测序鉴定表明成功构建pc DNA3.1(+)-NPM1质粒,将成功构建的质粒转染至pumc-91细胞,Western blot证实转染pc DNA3.1(+)-NPM1表达质粒的pumc-91细胞npm1蛋白过表达。结论成功构建pc DNA3.1(+)-NPM1重组质粒,为进一步研究NPM1蛋白的功能奠定基础。

pcDNA3.1(+)TPA构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达活性研究

目的 建立TPA基因在人脐静脉内皮细胞外源性表达的方法 ,为缺血性心脏疾病的基因治疗及防止血管再狭窄提供理论依据和新方法。方法 构建真核表达载体pcDNA3 1( +)TPA ,并采用脂质体法将其转入体外培养的人脐静脉内皮细胞 ,并观察外源性TPA表达情况。结果 真核表达载体pcDNA3 1( +)TPA在人脐静脉内皮细胞中获有效表达 ,酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为 5 68 6ng/10 6细胞 /2 4h ,未转pcDNA3 1( +)TPA的人脐静脉内皮细胞测得为 17 8ng/10 6细胞 /2 4h ;发色底物法测得外源性TPA活性为 10 8 8IU/10 6细胞 /2 4h ,未转pcDNA3 1( +)TPA的人脐静脉内皮细胞测得为 5 6IU/10 6细胞 /2 4h。结论 pcD NA3 1( +)TPA转入人脐静脉内皮细胞后 ,外源性TPA基因获有效表达 ,为缺血性心脏病的TPA基因治疗提供了理论依据和新方法。

构建不同筛选特性的HBV X基因真核表达载体

目的:构建不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体。方法:从质粒pEcob6中PCR扩增HBV X全基因,利用pCEP4和pcDNA3.1(+)两者多克隆位点的特点,选用pGEMR○-T Easy Vector构建中间载体pEasy-X,分别酶切后连接特异性片段构建载体pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X。结果:从质粒pEcob6成功PCR扩增出HBV X全基因并克隆至质粒pEasy-X,酶切、PCR及测序均证实真核表达载体质粒pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X构建成功。结论:具有不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体业已成功构建。

AIF重组质粒的构建、表达和功能的研究

目的构建人凋亡诱导因子(AIF)基因功能片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)AIF,并初步研究AIF在细胞凋亡中的作用。方法从人细胞中提取总RNA,RTPCR扩增AIF基因片段;克隆到pMD18T载体上,通过酶切和测序进行鉴定;将AIF基因片段插入pcDNA3.1(+),构建真核表达载体;电转化淋巴母细胞Raji细胞,观察AIF的表达水平和功能。结果成熟AIF蛋白分子在真核细胞中表达,并转移到细胞核中,诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。结论成功构建了pcDNA3.1(+)AIF真核表达载体,AIF在Caspase非依赖性细胞凋亡中发挥重要作用。

人CD40L真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞膜上的表达

目的:扩增人CD40L基因并在细胞膜上表达,建立一种不需蛋白纯化获得人CD40L的简单方法,为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用及机制奠定基础.方法:利用梯度RT-PCR从Jurkat细胞中扩增CD40L基因,测序证明序列正确后构建pcDNA3.1-40L真核表达载体,转染NIH3T3细胞,流式细胞仪检测目的基因的表达.结果:从Jurkat细胞内成功扩增人CD40L基因,筛选到一个序列无误的克隆;成功构建pcDNA3.1-40L真核表达载体;经转染NIH3T3细胞和G418初步筛选,流式细胞检测证明约41%的NIH3T3细胞膜上有CD40L基因表达.结论:利用RT-PCR技术可以从Jurkat细胞内扩增CD40L基因,利用pcDNA3.1表达载体可以实现人CD40L基因在NIH3T3细胞膜上的表达.

多发性骨髓瘤黏蛋白-1基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

本研究旨在构建多发性骨髓瘤黏蛋白1(两串联)基因(muc1-2vntr)的真核表达载体及该重组体在COS-7细胞中的表达,为研制多发性骨髓瘤基因疫苗奠定基础。以MUC1-2VNTR蛋白的编码基因作为目的基因,在其前端加上KOZAK序列后,两端分别加上HindⅢ和XbaⅠ酶的酶切位点,将人工合成的全基因定向插入pcDNA3.1/myc-his B载体中,转化E.coli感受态细胞获得重组菌株,经酶切及测序鉴定为pcDNA3.1-2vntr/myc-hisB重组质粒后,采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS-7细胞,用荧光显微镜对荧光表达进行观察,然后用Western blot检测重组体在细胞内外的表达。结果表明:合成的MUC1-2VNTR基因全长约140bp,所构建的pcDNA3.1-2vntr/myc-hisB重组质粒经双酶切及测序鉴定后,与预期片段大小相符,并含有完整的阅读框架和目的基因。将其转入COS-7细胞后48小时,荧光显微镜和Westernblot检测均可证实黏蛋白1表达。结论:成功的构建了多发性骨髓瘤真核表达载体pcDNA3.1-2vntr/myc-hisB,并在COS-7细胞中成功地表达黏蛋白1,这为黏蛋白1的功能研究和多发性骨髓瘤基因疫苗的研制提供了实验基础。

真核表达载体pcDNA3.1-h转化生长因子-β1的构建

目的 为研究软骨细胞基因转染的可行性创造条件 ,从而为基因修饰的软骨组织工程研究奠定基础。方法 应用基因重组技术和限制性内切酶酶切构建并鉴定 pcDNA3 .1 TGF β1真核表达载体 ,经Fugene6介导质粒转染 3T3细胞后应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测hTGF β1mRNA在真核细胞中的表达。结果 重组真核表达载体 pcDNA3 .1 TGF β1经限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ酶切 ,电泳后显示 1 .35kb的hTGF β1目的片段和 5 .40kb的 pcDNA3 .1载体片段 ,证明重组质粒连接正确 ;经RT PCR检测了hTGF β1在转录水平mRNA的表达情况 ,表明质粒转染 3T3细胞后hTGF β1mRNA的表达明显增强。 结论 重组真核表达载体构建正确 ,并能在真核细胞 3T3中表达hTGF β1mRNA 。

广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子(NGF)基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NGF,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法:采用RT-PCR的方法扩增蛇毒NGF的基因片段,将目的基因、真核表达载体pcDNA3.1(-)分别酶切后回收,连接、转化而构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-NGF,经酶切和测序对重组体进行鉴定。利用脂质体Lipofectamine～(TM) 2000方法转染NIH3T3细胞,对阳性克隆裂解上清中NGF的表达用SDS-PAGE、Western-blot的方法检测。结果:重组载体经酶切、测序分析,插入的基因片段为表达蛇毒NGF的基因,NGF基因在NIH3T3细胞中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NGF,并检测出在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步开展NGF基因治疗神经系统的疾病奠定了实验基础。

Survivin启动子驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的了解Survivin启动子在HepG2肝癌细胞与3T3细胞中诱导Trail蛋白表达能力的差异,并评价其驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的能力。方法以pGL3-surp340质粒为模板,扩增Survivin340启动子,构建重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail。将重组质粒分别转染HepG2肝癌细胞和3T3细胞,通过Western Blot检测两种细胞中Trail蛋白表达的差异。利用流式细胞术检测HepG2肝癌细胞及3T3细胞转染重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail后细胞凋亡的情况。结果成功构建了重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail,转染HepG2和3T3两种细胞后,通过Western Blot检测,HepG2肝癌细胞Trail蛋白表达的相对灰度值为0.49±0.43,较3T3细胞Trail蛋白表达(0.15±0.37)明显增强(P<0.05)。利用流式细胞术检测,HepG2肝癌细胞转染重组质粒组的凋亡率(%)为11.59±0.74,空白质粒组为3.45±0.52,未转染组为2.67±0.34;3T3细胞重组质粒组的凋亡率(%)为3.26±0.24,空白质粒组3.16±0.15,未转染组2.83±0.27。HepG2细胞转染重组质粒组凋亡率明显高于其他对照组(P<0.05)。结论含Survivin基因启动子的重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail在肿瘤细胞中能增强Trail蛋白的表达,并能诱导HepG2肝癌细胞凋亡。

人PIF1全长基因及其截短体真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人PIF1基因5端、3端及全长基因的真核表达载体。方法从pCR2.1-TOPO-PIF1原始质粒中,采用PCR方法扩增目的基因PIF1,PIF1N及PIF1C,将目的基因和目的载体pcDNA3.1(-)分别酶切;纯化酶切产物后定向连接,并将其转化大肠杆菌DH5α,对生长出的克隆行特异限制性内切酶酶切鉴定,鉴定为阳性的克隆送样测序。结果凝胶成像结果显示重组基因pcDNA3.1(-)-PIF1,pcDNA3.1(-)-PIF1N及pcDNA3.1(-)-PIF1C酶切后条带大小分别为1 926,540,1 428bp。结论成功构建hPIF1基因5端、3端及全长基因表达载体,分别为pcDNA3.1(-)-PIF1N,pcDNA3.1(-)-PIF1C及pcDNA3.1(-)-PIF1。

EndoA基因真核表达载体构建及其对皮肤表皮细胞的作用

瘢痕组织是人体创伤修复过程中的一种自然产物。然而，胚胎皮肤却具有创伤后无瘢痕愈合的能力。近年来研究发现无瘢痕愈合是胚胎皮肤固有的特性。我们通过构建真核表达载体pcDNA3．1／EndoA,并转染小鼠皮肤表皮细胞，研究EndoA对成鼠皮肤表皮细胞的作用。

多发性骨髓瘤MUCl-2VNTR真核表达载体构建及鉴定

目的构建多发性骨髓瘤（MM）黏蛋白MUCl-2VNTR基因的真核表达载体，为研制MM基因疫苗奠定基础。方法以MUCl-2VNTR的编码基因作为目的基因，在其前端加上COZAK序列后，两端分别加上HindⅢ和XbaI酶酶切位点，将人工合成的全基因定向克隆入pcDNA3．1／myc-hisB中，并通过酶切及测序进行鉴定。结果合成的MUCl-2VNTR基因全长约140bp，所构建的pcDNA3．11MUCl-2VNTR／myc-hisB重组体经双酶切及测序鉴定后，与预期片断大小相符，并含有完整的阅读框架和目的基因，证明构建成功。结论成功地构建了MM真核表达载体pcDNA3．1／MUCl-2VNTR／myc-hisB，为MUCl黏蛋白的功能研究和MM基因疫苗的研制奠定了相应的实验基础。