pcDNA3.1-Egr.1p-p16基因联合放射治疗对裸鼠肿瘤的作用

目的:探讨pcDNA3.1 Egr.1p p16基因联合放射治疗移植人胰腺癌细胞JF 305裸鼠的抗肿瘤作用的 适宜照射剂量和质粒注入量。方法:不同剂量X射线照射(2,10,20Gy)及瘤内不同量脂质体包裹的pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒(10,20,30μg)注入接种JF305胰腺癌细胞的裸鼠体内,测定各组裸鼠体积以观察各种处理抑瘤效 应的差异,并用RT PCR检测放射治疗后48h各组肿瘤局部p16mRNA水平。结果:质粒注入后接受20GyX射线 照射组照射后4～28d,肿瘤生长速率明显低于2Gy和10Gy照射组(P<0.05)。质粒注入量为20μg或30μg的 联合治疗组照射后4～28d,肿瘤生长速率明显低于注入量为10μg的联合治疗组(P<0.05)。单纯接种 pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒组和接种pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒照射组小鼠的肿瘤组织内有p16mRNA表达,且 pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒照射组的p16mRNA水平明显高于单纯pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒组(P<0.05)。结 论:pcDNA3.1 Egr.1p p16基因联合放射治疗小鼠体内抗肿瘤作用的适宜射线照射剂量为20Gy,质粒注入量为20 μg;pcDNA3.1 Egr.1p p16基因联合放射治疗的抗肿瘤作用明显优于单纯放射治疗或单纯基因治疗,这可能与辐射 激活Egr.1p基因后增强抑瘤基因p16的表达有关。

真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B的改构与应用

目的:对真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B进行改构,以简化目的基因克隆的步骤。方法:用事先设计好的2条寡核苷酸链互相退火,替换pcDNA3.1-myc-his(-)B的多克隆位点中NotⅠ与HindⅢ间的部分;利用改构的真核表达载体,分别构建亲环蛋白A、胆绿素还原酶B和过氧化氢酶基因的重组真核表达载体,瞬时转染293T细胞后,用His标签抗体验证其表达。结果:测序结果证实已将预想的序列替换至pcDNA3.1-myc-his(-)B的多克隆位点中相应位置,改构为质粒pcDNA3.1(-)reconstruct;利用改构的真核表达载体表达了相应的目的基因。结论:改构的真核表达载体pcDNA3.1(-)reconstruct可以简化融合myc和His标签的目的基因克隆的过程,并且增加了限制性位点的可选择性。

人β地中海贫血突变基因重组载体pcDNA3.1-LCR-β^(41/42)的构建

目的构建人β地中海贫血突变基因β41 /42及具有调控功能的基因座控制区(LCR)重组载体,为该病基因治疗的体外细胞模型和转基因小鼠模型的建立奠定基础。方法抽提β41 /42纯合子患者的DNA,PCR扩增人β珠蛋白基因座控制区 (LCR)和β41 /42基因,将其串联克隆至pcDNA3. 1 中,酶切及测序鉴定重组载体。结果所构建的重组载体中含人β珠蛋白基因座控制区(LCR)和β41 /42基因,测序结果及引入方向正确。结论成功构建了含 5. 5kgβ珠蛋白基因座控制区(LCR)的β41 /42人重型地中海贫血基因的重组载体。

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的:构建含MAGE-1基因的重组真核表达质粒。方法:用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至pGEM-T载体,测序证实基因碱基序列无误后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒。结果与结论:RT-PCR获得长度为927bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3.1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1-MAGE-1构建成功。

PRRSV tGP5基因克隆及pcDNA3.1-tGP5真核表达载体的构建

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株ORF5基因的核苷酸序列设计一对特异性引物,用PCR扩增PRRSV GP5蛋白非中和性表位缺失的tGP5基因,将基因定向连接在真核表达载体pcDNA3.1的HindⅢ和EcoRⅠ多克隆位点之间,构建重组质粒pcDNA3.1-tGP5。转化DH5α感受态大肠埃希菌,提取质粒。重组质粒经PCR、双酶切鉴定及DNA序列测定,成功构建了pcDNA3.1-tGP5基因的重组体。

子宫内膜中TLR4的定位及pcDNA3.1-TLR4载体的构建

试验旨在研究TLR4(Toll like receptor4)蛋白在子宫内膜组织中具体的分布与表达,从而构建TLR4真核表达载体,为TLR4在细胞水平上的功能研究提供一种技术手段.选择早期妊娠绵羊(9d、13d、17d、21d、25d)子宫组织,采用免疫组织化学和细胞免疫学抗体着色法检测各阶段子宫组织中TLR4蛋白的分布与表达,确定受体蛋白的表达部位.同时将构建的pcDNA3.1-TLR4质粒转染到确定的受体细胞,检测TLR4蛋白的表达水平.结果表明:TLR4蛋白在子宫内膜各部位均有表达,呈一定的动态时空模式,且第17d胚胎附植后主要表达于内膜基质细胞;重组质粒转染到基质细胞后,TLR4蛋白的表达水平明显增强.此研究成功构建pcDNA3.1-TLR4表达载体,为TLR4在生殖细胞免疫学功能的研究奠定了一定的理论基础.

pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体的构建及扩增

目的构建并扩增pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体。方法目的基因全基因合成,PCR加入酶切位点,连接入pGEM-Teasy载体,经酶切鉴定及测序后获得测序正确的目的基因。连接入真核表达载体pcDNA3.1(-),再经酶切鉴定及测序后进行pcDNA3.1-FKBP12.6的扩增。结果成功构建并扩增pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体。结论pCDNA3.1-FK-BP12.6表达载体的构建,为深入研究FKBP12.6基因对心肌细胞结构和功能的影响奠定基础,进而为探索安全、高效的心肌功能异常的治疗提供新的途径。

质粒pcDNA3.1-IL-24的制备和纯化

探索基因治疗用质粒pcDNA3.1-IL-24的规模化制备和纯化工艺。碱性裂解提取质粒后,以异丙醇和LiCl沉淀法去除大分子RNA。然后,使用DEAE Sepharose FF离子交换层析去除染色体DNA、小分子RNA、蛋白质等杂质。经本工艺纯化的质粒pcDNA3.1-IL-24浓度为727μg/mL,纯度为1.87,蛋白质含量为0.007μg/mL质粒DNA,未检测到RNA、抗生素残留。此工艺避免使用动物源性酶类及有毒试剂,有效去除质粒DNA制备过程中产生的杂质,可实现药剂水平质粒DNA的规模制备。

Notch1基因C端特征结构域pcDNA3.1-AN真核表达载体的构建

目的:扩增人胎盘组织Notch1基因C端特征性结构域ANK和NLS(简称AN),并构建pcDNA3.1-AN真核表达载体。方法:按照GenBank中Notch1序列,设计一对引物,利用RT-PCR方法从人胎盘组织中获取ANcDNA片段,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-AN。结果:所获得的序列是Notch1特征性的AN结构域。结论:成功构建了pcDNA3.1-AN真核表达载体。

pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepa1-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因编码区全长序列,测序确认后,插入到pcDNA3.1真核表达载体中,双酶切鉴定。用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞,检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况。结果成功克隆了mAFP基因编码区全长序列,构建出重组真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达。结论该研究成功构建了重组pcDNA3.1-mAFP真核表达载体,为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础。

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。

真核表达质粒pcDNA3.1-asHpa的构建及意义

目的 :构建乙酰肝素酶信号密码的反义基因真核表达载体 ,探索恶性肿瘤基因治疗的新途径。方法 :以质粒pcDNA3.1为载体 ,将乙酰肝素酶信号密码的DNA片段反向插入其多克隆位点得到反义乙酰肝素酶信号密码真核表达载体 (pcDNA3.1-asHpa)。 结果 :经过PCR扩增鉴定、电泳证实获得的重组基因插入方向和插入序列大小正确。结论 :成功的构建了乙酰肝素酶信号密码的反义基因真核表达载体 。

HO-1基因真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1的构建及表达

目的:构建人HO-1真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1并检测其表达。方法:利用分子生物学技术,将hHO-1基因与质粒pcDNA3.1连接,构成重组质粒并用RT-PCR及Western blotting方法检测重组载体在Eca-9706细胞中的表达情况,最终确定重组载体是否构建成功。结果:用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,RT-PCR检测,Western blotting检测证明hHO-1成功克隆入表达载体pcDNA3.1中。结论:本部分实验成功构建了能够在细胞内大量表达HO-1基因产物的真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1,为进一步实验奠定基础。

质粒pcDNA3.1-asHpa的构建及意义

目的 :构建乙酰肝素酶信号密码的反义基因真核表达载体 ,探索恶性肿瘤基因治疗的新途径。方法 :以质粒 pc DNA3.1为载体 ,将乙酰肝素酶信号密码的 DNA片段反向插入其多克隆位点得到反义乙酰肝素酶信号密码真核表达载体 ( pc DNA3.1 - as Hpa)。结果 :经过 PCR扩增鉴定、电泳证实获得的重组基因的大小和插入方向正确。结论 :成功的构建了乙酰肝素酶信号密码的反义基因真核表达载体 。

pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 :构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体 (hTSHR)基因真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :以限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR ,获得hTSHRcDNA的全长片段 ,在以低熔点琼脂糖回收纯化后 ,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点中 ,构建重组体pcDNA3.1/hTSHR ,进行酶切、PCR及测序鉴定。通过脂质体介导 ,转染COS 7细胞进行瞬时表达 ,并用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测hTSHR的表达。结果 :双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR得到约 2 70 0bp含TSHR全长cD NA的片段 ,同预期片段的大小相符。所构建的pcDNA3.1/hT SHR经双酶切及PCR鉴定同预期大小相符 ;测序结果与Gen Bank中收录的hTSHR全长序列一致 ,表明真核表达质粒构建正确。以脂质体转染COS 7细胞后 ,用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测表明 ,细胞可表达hTSHR。结论 :成功地构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/hTSHR ,为进一步研究TSHR的功能 ,以及利用hTSHR真核表达载体建立Graves实验动物模型奠定了基础。

pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白在大鼠鞘内注射的表达

目的：构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）并观察其存大鼠体内的转染部位及表达时间。方法：构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔，观察其存大鼠体内转染后的时空效应。结果：双酶切结果符合真核表达载体pcDNA3.1（＋）约5.4kb，EGFP约750bp，另外测序分析与文献报道结果完全一致；动物实验结果表明，鞘内注射24h后存大鼠的脑脊膜和脊神经的外膜上有EGFP表达，在14d达到高峰，4周后明显下降，第7周消失；在实验组大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有绿色荧光。对照组所有取材部位均没有绿色荧光。结论：重组质粒pcDNA3.1（＋）-EGFP通过直接注射法被成功转染至大鼠的蛛网膜下腔，且外源基因得到了表达。

重组体pcDNA3.1(+)-tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

[目的]克隆酪氨酸酶基因(tyr),构建pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞表达。[方法]用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段,利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)的T7启动子下游,并用脂质体法导入NIH3T3细胞,RT-PCR,酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。[结果]成功克隆1.74kb的全长tyr cDNA片段,经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致,tyr准确克隆入pcDNA3.1(+)的多克隆位点,RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。[结论]本实验成功构建了pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中表达。

pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体构建、转染及其对人鼻咽癌细胞CNE-2增殖的影响

目的构建pcDNA3.1(+)-血清淀粉样蛋白A(SAA)真核表达载体,观察其在人鼻咽癌细胞CNE-2中的表达及对CNE-2增殖的影响。方法以CNE-2细胞的cDNA为模板,通过PCR扩增得到SAA片段,经酶切、纯化后与pcDNA3.1(+)连接;重组质粒经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染法转染人鼻咽癌细胞CNE-2,用Western blot法检测转染前后该细胞中SAA蛋白的表达,并用MTT法检测转染重组质粒后的细胞增殖情况。结果 pcDNA3.1(+)-SAA经酶切、测序鉴定完全正确,真核表达载体构建成功;转染pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体后CNE-2细胞中SAA蛋白表达水平明显高增高;转染pcDNA3.1(+)-SAA后CNE-2细胞增殖速度加快。结论成功构建pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体,其能稳定表达于人鼻咽癌细胞CNE-2并促进细胞增殖;此为进一步研究SAA的生物学功能及鼻咽癌的新型治疗方法奠定了基础。

pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体内表达的实验性研究

目的获得重组pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝内的高效稳定表达。方法采用流体动力法将表达mB7-H4-hIg融合蛋白的真核表达载体输注小鼠体内,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和实时定量PCR(RT-PCR)的方法,定量检测pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体的内表达。结果经尾静脉注射的pcDNA3.1/mB7-H4-Fc能在肝组织中稳定表达,在48h时间点分泌的量达到最高,最大量约120ng/mL。结论成功将pcDNA 3.1/mB7-H4-Fc表达载体导入了小鼠肝脏,并获得了pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝内的高效稳定表达。

大鼠PDZ1-FLAG的亚克隆及pcDNA3.1载体的构建

目的亚克隆大鼠PDZ1-FLAG基因片段并构建pcDNA3.1载体。方法以pAdTrack-CMV-PDZ1为模板,采用PCR法获得PDZ1-FLAG的双链DNA;与pcDNA3.1载体用T4DNA连接酶连接;连接产物转化大肠杆菌JM109进行筛选、序列测定。结果①得到了PDZ1-FLAG的双链DNA;②酶切鉴定能观察到PDZ1-FLAG和pcDNA3.1两条带;③PDZ1-FLAG测序图谱与文献报道完全一致。结论获得了含目的基因PDZ1-FLAG的pcDNA3.1载体。