pcDNA3.1-BMP-2真核表达载体构建及转染兔骨髓基质细胞的实验研究

目的 构建人骨形态发生蛋白2(BMP-2)真核表达载体,鉴定并转染兔骨髓基质细胞,为转基因治疗骨缺失疾病提供实验基础。方法 双酶切克隆载体将BMP-2目的基因与真核表达载体pcDNA3.1连接,免疫组化及Western blotting检测转染BMP-2基因骨髓基质细胞的表达效果。结果 成功构建BMP-2真核表达载体,转染骨髓基质细胞后,有BMP-2表达。结论 骨髓基质细胞经基因转染后可以表达BMP-2,为进一步实验研究提供基础。

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及血管内皮生长因子表达的影响

目的 构建人骨形成蛋白 - 2 (h BMP- 2 )真核表达载体 pc DNA3.1- h BMP- 2 ,转染人骨髓基质干细胞(MSCs) ,探讨基因转染对其增殖和血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响。 方法 利用重组 DNA和基因克隆技术构建重组载体 pc DNA3.1- h BMP- 2 ;细胞培养和基因转染技术体外转染人 MSCs;免疫细胞化学、原位杂交和蛋白印迹法检测细胞 BMP- 2的表达 ;通过流式细胞仪和 VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖和 VEGF表达的影响。 结果 转染后细胞在 m RNA水平和蛋白质水平均表达 BMP- 2 ;转染后 S期细胞比例增多 ,提示细胞 DNA的合成增加 ;BMP- 2基因转染上调细胞 VEGF的表达。 结论 在脂质体介导下 ,pc DNA3.1- h BMP- 2转染 MSCs获得成功。基因转染后能促进细胞增殖并将通过使 VEGF的表达增加促进血管再生 ,为进一步骨缺损的基因治疗及构建组织工程骨奠定了实验基础。

转化生长因子β2真核表达载体pcDNA3.1(+)/TGF-β2的构建及其在骨髓基质细胞的表达

目的 :构建人转化生长因子 β2的真核表达载体 pcDNA3.1(+) /TGF - β2 ,检测其转染骨髓基质细胞后的表达。方法 :用PCR方法从人胎盘cDNA文库DNA中扩增TGF - β2全长cDNA ,该基因片段两端设计了NheⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将TGF - β2的cDNA构建到真核表达载体 pcDNA3.1(+)上 ,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术 ,将所构建的载体导入从骨髓中分离培养的基质细胞中 ,体外单层培养。分别于转染后 2 4h和 4周利用RT -PCR和Western -Blotting方法检测目的基因的表达情况。结果 :经琼脂糖凝胶电泳及测序证实 ,PCR获得的片段与GenBank中登记的TGF - β2cDNA序列完全相同。pcDNA3.1(+) /TGF - β2酶切片段的长度与理论大小相符。转染后不同时期的骨髓基质细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到TGF - β2的表达。结论 :pcDNA3.1(+) /TGF - β2真核表达载体构建成功 。

牛DKK2基因pcDNA3.1表达载体的构建

DKK2基因是Wnt信号通路的关键抑制因子,在胚胎发育、颗粒细胞生成等过程中发挥重要作用。扩增了牛DKK2基因CDS序列,构建了DKK2基因pc DNA3.1真核表达载体;为进一步验证载体在细胞内的表达效果,将表达质粒瞬时转染CHO细胞,利用q RT-PCR和Western blot检测DKK2的表达情况。结果表明,在CHO细胞中转染DKK2基因的真核表达载体质粒,其m RNA和蛋白质表达量均显著上升,表明已成功构建了DKK2基因表达载体,为下一步开展DKK2基因功能研究奠定了基础。

pcDNA3.1-Bcl-2真核表达载体构建

目的克隆大鼠Bcl-2基因(B cell lymphoma)全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体,测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1-Bcl-2重组质粒。结果RT-PCR获得长度为720bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3.1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1-Bcl-2构建成功。结论成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1-Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。

猪圆环病毒2型ORF2基因在PcDNA3.1中的表达效果

[目的]构建猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)ORF2 DNA核酸疫苗,并评价其免疫效果和安全性。[方法]设计一对特异性引物,扩增PCV2-ORF2,利用T载体对其进行克隆,与真核表达载体PcDNA3.1在同等条件下进行双酶切,并进行连接,转化感受态细菌DH5α并克隆,经双酶切鉴定筛选阳性重组质粒,即DNA核酸疫苗,命名为PcDNA3.1-ORF2。将该核酸疫苗瞬时转染Vero细胞,通过RT-PCR鉴定其在细胞内的表达情况;并且将该核酸疫苗按100μg.只-1腿部肌肉注射免疫Balb/c小鼠,同时设PBS和PcDNA3.1空载体为对照,免疫2次,间隔2周。分别于首免后第14 d和第28 d采血,用ELISA方法检测其血清抗体。取首免后56 d小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑等实质器官,采用PCR方法检测该核酸疫苗的安全性。[结果]成功地构建了PcDNA3.1-ORF2核酸疫苗,在体外Vero细胞中得到了瞬时表达,并且能诱导小鼠产生较强的免疫应答。安全性试验表明该核酸疫苗未整合到小鼠染色体上。[结论]PcDNA3.1-ORF2核酸疫苗可以诱导小鼠产生较强的免疫应答,并且是安全的。

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。

PcDNA3.1(+)/CYP11B2真核表达质粒的构建及其在NCI-H295R细胞中的表达

目的构建人醛固酮合成酶基因(CYP11B2)的真核表达质粒,并在人肾上腺上皮细胞(NCI-H295R)中表达,为下一步定点突变研究奠定基础。方法从人的肾上腺组织中提取总的RNA,采用RT-PCR扩增法扩增人的CYP11B2全长cDNA并克隆到PMD18-T载体中,然后再亚克隆于PcDNA3.1(+)真核表达载体,通过菌液PCR和酶切鉴定重组真核表达质粒,并以DNA测序证实。利用阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染NCI-H295R,RT-PCR和放射免疫法(RIA)检测CYP11B2基因的表达。结果菌液PCR扩增和酶切证实真核表达质粒构建成功,测序表明CYP11B2基因cDNA全长(1 509bp)和GenBank上公布的序列(D13752)相比较,存在一个碱基差异A3323G,这个变异使得第173位的赖氨酸变为精氨酸,核苷酸序列的同源性为99.9%,氨基酸序列的同源性为99.8%。真核表达质粒转染人肾上腺上皮细胞后CYP11B2 mRNA表达增加,细胞上清中的醛固酮含量显著增加。结论①通过查阅国外SNP数据库得知K173R为一个SNP位点,编号为rs4539。②成功构建了人CYP11B2基因的真核表达质粒,阳离子脂质体是NCI-H295R有效的体外转染体系,本实验为进一步研究该基因的结构与功能关系奠定了基础。

蛛网膜下腔注射pcDNA3.1(+)-hPPE对大鼠神经病理性痛的镇痛效应

目的:观察蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE对大鼠神经痛的镇痛作用。方法:SD大鼠随机分为坐骨神经慢性压迫(CCI)组、CCI假手术组、实验组和空质粒组。CCI组和CCI假手术组,用于观察疼痛持续时间;实验组和空质粒组分别于CCI术后第15天蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE和空质粒pcDNA3.1(+)。测定各组注射质粒前后CCI模型鼠双后肢热痛阈(PWTL),观察纳洛酮对镇痛效应的影响,用放射免疫法检测脑脊液灌流液中脑啡肽(L-ENK)的含量,同时采用免疫组织化学方法测定两组大鼠脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体2B亚基(NR2B)表达的变化。结果:CCI术后7～33d,术侧PWTL明显低于对照侧。空质粒组注射前后热痛阈未见明显变化;与空质粒组相比,实验组大鼠蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE后的第3天产生明显的抗伤害效应(PTWL升高),持续镇痛长达18d,且镇痛效应能被纳洛酮翻转。实验组脑脊液灌流液L-ENK含量显著高于空质粒组。与空质粒组比较,实验组大鼠脊髓背角NR2B阳性蛋白表达明显受到抑制。结论:蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE能够减轻大鼠神经病理性疼痛的热痛敏行为。

膜联蛋白A2质粒的构建及其在膀胱癌pumc-91细胞增殖和迁移中的作用

目的膜联蛋白A2(annexin A2,Anxa2)在多种肿瘤细胞中具有调节生物活性的作用。本研究旨在探讨Anxa2蛋白的表达与膀胱癌pumc-91细胞增殖和迁移的相关性。方法扩增ANXA2序列,插入pcDNA3.1(+)载体,制备pcDNA3.1(+)-ANXA2质粒。用脂质体lipo2000将pcDNA3.1(+)-ANXA2瞬时转染至pumc-91膀胱癌细胞中。Western blotting检测空白组、转染pcDNA3.1(+)空载的对照组和转染pcDNA3.1(+)-ANXA2质粒的实验组中Anxa2蛋白的表达。利用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测pumc-91细胞的增殖能力,transwell实验检测pumc-91细胞的迁移水平。采用单因素方差分析或重复测量的方差分析比较各组间检测数据的差异。结果PcDNA3.1(+)-ANXA2质粒构建成功,测序完全正确。Western blotting检测显示,与空白组和对照组相比,实验组Anxa2蛋白表达水平增高。CCK8实验显示实验组增殖的pumc-91细胞数量相比于空白组(P<0.001)和对照组(P=0.001)明显增多;transwell实验中实验组穿膜的pumc-91细胞数量较空白组(P=0.011)和对照组(P=0.027)也明显增多。结论Anxa2蛋白的表达上调可能在膀胱癌pumc-91细胞增殖和迁移中起重要作用。

人白细胞介素12双亚基共表达载体的构建及表达

目的 :为了基因治疗研究的需要构建人白细胞介素 12 (hIL 12 )双亚基基因共表达质粒 [(P(+) IL 12 ) ],比较它与单个亚基基因表达质粒 [P(+) P4 0 和P(- ) P35]1∶1共同转染肝癌细胞HepG2后 4 8小时表达结果。方法 :分别克隆hIL 12P4 0 、P35亚基cDNA全长至pcDNA3 1(± )中构建P(+) P4 0 和P(- ) P35,再将两者串联克隆至pcDNA3 1(+)中构建P(+) IL 12。脂质体转染 3种质粒至肝癌细胞HepG2 ,4 8小时后抽取细胞总RNA做半定量RT PCR ,同时取细胞上清做ELISA及Western杂交 ,结果进行比较分析。结果 :两种转染方式均可以表达hIL 12蛋白质且半定量RT PCR显示较未转染组hIL 12的mRNA水平均增加 ;转染后 4 8小时P(+) IL 12组细胞培养上清hIL 12表达量较 [P(+) P4 0 和P(- ) P35]按 1∶1比例共同转染组显著增高(P <0 0 5 )。结论 :人白细胞介素 12双亚基基因串联共表达质粒 [P(+) IL 12 ]能够转入HepG2并表达hIL 12蛋白质 ,并且转染后 4 8小时hIL 12表达量较单个亚基基因表达质粒 [P(+) P4 0 、P(- ) P35]1∶1共转染者显著高。

小鼠B7-2基因的克隆、测序及其重组质粒的构建

目的 :克隆小鼠 B7- 2基因编码区的 c DNA序列 ,并构建其表达载体。方法 :利用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)法 ,以小鼠脾细胞 m RNA为模板 ,扩增获得 B7- 2基因 ,与 p MD- 1 8T连接做全自动测序 ,并利用基因重组技术构建包含 B7- 2基因的表达质粒 pc DNA3.1 - CMV- B7- 2及 pc DNA3.1 - Egr- B7- 2。结果 :经测序证实获得的 B7- 2基因与文献报道的基本一致 ,并成功地构建了表达质粒。结论 :成功克隆了 B7- 2的编码基因 ,并成功构建了表达载体 pc DNA3.1 - CMV- B7- 2及 pc DNA3.1 - Egr- B7-

犬新孢子虫NcSRS2基因真核表达质粒的构建

根据犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计了1对含有Kozak序列、PstⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物,以含有NcSRS2基因的质粒P43为模板,经PCR扩增获得NcSRS2ORF基因片段,用PstⅠ和XbaⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSR2ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1(+)真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。

PCV-2 ORF2基因的真核表达及其体内分布和安全性检测

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR从广西PCV-2的DNA扩增出ORF2基因,将ORF2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)载体上,获得重组质粒,经PCR酶切以及序列分析鉴定,表明插入的片段为ORF2目的基因,插入的位置、大小和阅码框均正确,成功构建了真核表达载体重组质粒pcDNA-PCV-ORF2。对阳性真核表达质粒pcDNA-PCV-ORF2大量抽提后,以每只小鼠0.2 mg免疫5周龄左右的雌性小鼠,然后用ELISA检测免疫小鼠血清中抗体的产生情况,同时进行pcDNA-PCV-ORF2的体内分布和安全性检测。结果表明,pcDNA-PCV-ORF2在小鼠体内广泛存在,产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第7天开始产生抗体,第28天抗体水平达到最高,抗体可维持7周以上,并具有良好的安全性。本研究通过对小鼠的免疫试验,产生了猪圆环病毒的特异性抗体,表明成功构建了能够在活体细胞中高效表达的真核表达载体,为进一步研究猪圆环病毒DNA疫苗奠定了基础。

猪新基因CFL2真核表达载体的构建及在C2C12细胞中的瞬时表达

从猪的股二头肌中提取总RNA,利用RT-PCR技术从猪骨骼肌中获得CFL2基因的编码区序列,T-A克隆至PMD-18T载体,经HindⅢ和XhoⅠ酶切后定向克隆至真核表达载体pCDNA3.1(+)中。获得的重组质粒pCDNA3.1(+)/CFL2用限制性内切酶酶切分析和DNA测序分析鉴定,并经脂质体瞬时转染C2C12细胞,最后利用PCR检测转基因细胞中CFL2基因的存在及其表达情况。结果显示:猪CFL2基因已克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)中,转染的C2C12细胞中检测到细胞内较高量CFL2的表达。pCDNA3.1(+)/CFL2真核表达载体的成功构建,为深入研究CFL2基因在猪肌肉细胞中的功能奠定基础,为猪肉质品质的改良提供了新的思路。

含抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒重组体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒。方法:将抗凋亡基因bcl-2片段从载体pcDNA3.1中切下,定向插入逆转录病毒载体PLNCX2中,酶切鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定表达bcl-2的细胞株。结果:双酶切鉴定,成功构建重组逆转录病毒载体;重组逆转录病毒转入包装细胞PT67,经G418筛选,形成了抗性克隆,并测得病毒滴度为3×1011cfu/L,提示构建的含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论:含抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒载体构建成功。

禽呼肠孤病毒σ_2基因的真核表达及其免疫效果研究

采用RT-PCR技术扩增禽呼肠孤病毒ARV S1133毒株和广西分离株R1的σ2基因,将σ2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)载体上,对获得的重组质粒经PCR酶切以及序列分析鉴定。结果表明,插入的片段为σ2目的基因,插入的位置、大小和阅码框架均正确,成功构建了真核表达载体重组质粒pcDNA-S1133-σ2、pcDNA-R1-σ2;分别免疫SPF鸡2次后,用ARV S1133进行攻毒,使用RT-PCR方法进行检测,结果表明,pcDNA-S1133-σ2、pcDNA-R1-σ2 DNA疫苗免疫组检出率与对照组差异显著(p<0.05),与灭活苗免疫组及σ2蛋白免疫组差异不显著(p>0.05)。使用ARVσ2基因构建的真核表达质粒来免疫SPF鸡,鸡只获得了较好的免疫保护作用。

SOCS2真核表达载体的构建及在3T3-L1前体脂肪细胞中的表达

细胞因子信号抑制蛋白(SOCS)是细胞因子信号通路的重要负调控因子。构建SOCS2真核表达载体并转染3T3-L1前体脂肪细胞,为研究SOCS2对不同细胞因子调控脂代谢奠定基础。取小鼠皮下脂肪提总RNA进行RT-PCR,克隆获得pMDl8-SOCS2质粒载体,双酶切目的基因,并克隆至质粒载体pcDNA3.1,成功构建了重组质粒载体pcDNA3.1-SOCS2;重组质粒瞬时转染3T3-L1前体脂肪细胞系,以未转染和空载体转染作为对照,RT-PCR和Western blotting检测重组质粒转染组SOCS2核酸和蛋白表达,表达水平均显著高于对照组,为进一步研究SOCS2基因对不同细胞因子调控脂肪代谢提供基础。

小鼠Foxc2质粒载体的构建及功能鉴定

构建pcDNA3.1-Foxc2真核表达载体,并以脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,探究Foxc2对脂代谢的影响。取孕后15d小鼠腹部脂肪组织提取总RNA,用PCR扩增Foxc2全长序列并连接至pMD18-T载体,测序正确后克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,成功构建pcDNA3.1-Foxc2重组质粒载体。重组质粒转染3T3-L1前体脂肪细胞系,以未转染和空载体转染作为对照,通过RT-PCR和Western blotting法检测Foxc2核酸及蛋白表达,同时检测3T3-L1前体脂肪细胞中脂代谢相关基因FAS、ATGL、HSL及PPARγ的表达。结果显示,重组质粒转染组细胞中Foxc2的核酸和蛋白水平均显著高于对照组。同时发现超表达Foxc2显著降低FAS表达,显著升高HSL及PPARγ的表达,但是对ATGL的表达无显著影响,表明Foxc2具有抑制脂肪沉积的功能。

汉坦病毒H8205株MIL-2融合基因的构建

目的研究汉坦病毒新型裸DNA疫苗,构建融合基因pcDNA3.1/HisBIL2M(G1+G2)。方法采用PCR扩增汉坦病毒H8205株G1和G2基因片段,将回收的G1和G2片段经双酶切插入到pcDNA3.1/HisBIL2,构建成新的质粒pcDNA3.1/HisBIL2M。结果融合基因转录一分子量为100kD左右的蛋白,对照组则未见电泳条带出现,回收的片段与预期的相符。结论成功构建pcDNA3.1/HisBIL2M融合基因。