子宫内膜中TLR4的定位及pcDNA3.1-TLR4载体的构建

试验旨在研究TLR4(Toll like receptor4)蛋白在子宫内膜组织中具体的分布与表达,从而构建TLR4真核表达载体,为TLR4在细胞水平上的功能研究提供一种技术手段.选择早期妊娠绵羊(9d、13d、17d、21d、25d)子宫组织,采用免疫组织化学和细胞免疫学抗体着色法检测各阶段子宫组织中TLR4蛋白的分布与表达,确定受体蛋白的表达部位.同时将构建的pcDNA3.1-TLR4质粒转染到确定的受体细胞,检测TLR4蛋白的表达水平.结果表明:TLR4蛋白在子宫内膜各部位均有表达,呈一定的动态时空模式,且第17d胚胎附植后主要表达于内膜基质细胞;重组质粒转染到基质细胞后,TLR4蛋白的表达水平明显增强.此研究成功构建pcDNA3.1-TLR4表达载体,为TLR4在生殖细胞免疫学功能的研究奠定了一定的理论基础.

pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体内表达的实验性研究

目的获得重组pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝内的高效稳定表达。方法采用流体动力法将表达mB7-H4-hIg融合蛋白的真核表达载体输注小鼠体内,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和实时定量PCR(RT-PCR)的方法,定量检测pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体的内表达。结果经尾静脉注射的pcDNA3.1/mB7-H4-Fc能在肝组织中稳定表达,在48h时间点分泌的量达到最高,最大量约120ng/mL。结论成功将pcDNA 3.1/mB7-H4-Fc表达载体导入了小鼠肝脏,并获得了pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝内的高效稳定表达。

脂多糖对胚胎附植期Toll样受体4及相关免疫因子的影响

试验旨在探讨脂多糖(LPS)对绵羊胚胎附植期Toll样受体4(TLR4)及相关免疫因子表达的影响。以构建好的pcDNA3.1-TLR4过表达载体转染绵羊子宫内膜基质细胞,运用Western blotting技术鉴定细胞转染效果,然后用1μg/L LPS刺激转染后的子宫内膜基质细胞,建立内膜基质细胞炎症模型。将经LPS处理的细胞分别培养12、24、48、72h,采用实时荧光定量PCR技术和Western blotting法检测内膜基质细胞中TLR4mRNA及蛋白表达量,以及免疫因子IL-1β和IL-6的mRNA表达水平,并以未经LPS处理的细胞作为对照。结果显示,与对照组相比,LPS促进了免疫因子IL-1β、IL-6的释放量,但随LPS作用时间的延长,细胞中IL-6的表达量逐渐下降,而IL-1β的表达量逐渐升高,使得Th1/Th2偏向不利于妊娠的Th1方向表达;TLR4mRNA相对表达量在12、24、72h均显著高于对照组(P<0.05),48h时极显著高于对照组(P<0.01),且LPS处理后的细胞TLR4蛋白表达量也始终高于对照组。综上所述,pcDNA3.1-TLR4过表达载体成功转入绵羊子宫内膜基质细胞;LPS有效激活了子宫内膜细胞中TLR4信号通路,并促进了下游因子的表达;子宫蜕膜组织中TLR4受体蛋白对胚胎附植早期妊娠微环境的平衡维持也起到了重要作用。

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

[目的]构建犬黑皮质素受体4真核表达载体并在COS-7细胞中进行瞬间表达。[方法]以犬MC4R线性DNA为模板,进行引物设计,PCR特异性扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)。重组体pcD-NA3.1(+)-MC4R经过酶切和测序鉴定。采用FuGENE HD介导转染技术将pcDNA3.1(+)-MC4R导入COS-7细胞,提取细胞内总RNA,RT-PCR扩增犬MC4R基因的全长cDNA编码序列。[结果]克隆犬MC4R基因的全长cDNA序列,并以pcDNA3.1(+)表达载体为骨架,构建真核表达载体,测序的扩增片段与GenBank公布的模板序列经Blast比对相似性为99%。采用G418筛选,获得带有pcDNA3.1(+)-MC4R的COS-7细胞。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1(+)-MC4R,重组体能在真核细胞中表达。

重组白细胞介素-4增强日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗诱导小鼠的保护力

目的探讨重组白细胞介素-4(IL-4)真核表达质粒增强日本血吸虫组织蛋白酶BDNA疫苗对小鼠的免疫保护效果。方法将小鼠IL-4基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1以构建小鼠重组IL-4表达质粒,并联合日本血吸虫组织蛋白酶B的表达质粒DNA(VR1012-Sj31)肌注免疫小鼠,设重组IL-4表达质粒、组织蛋白酶B表达质粒和2种空载体质粒对照组。免疫组化检测IL-4和组织蛋白酶B在小鼠肌细胞内的表达,末次免疫3周后攻击感染,用减虫率及减卵率表示保护力。结果重组IL-4和组织蛋白酶BDNA均在小鼠肌细胞表达,重组IL-4和组织蛋白酶BDNA联合免疫小鼠,产生43.2%的减虫率和76.6%的减卵率,与组织蛋白酶BDNA单独免疫相比差异有显著性(P<0.01,P<0.05)。结论重组IL-4能提高日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗的抗血吸虫保护力作用,具有佐剂的免疫效应。

Gadd45a表达质粒的构建及在人类T细胞中的表达(英文)

目的:构建Gadd45a表达质粒,并诱导该质粒在人类T细胞中的表达。方法:采用反转录PCR法从人胚胎干细胞中扩增Gadd45a的蛋白质编码框,将之克隆至pcDNA3.1载体后,利用电穿孔方法将构建好的表达质粒pcDNA3.1-Gadd45a和空白质粒pcDNA3.1分别转染至Jurkat细胞或正常人CD4+T细胞,分别用荧光定量RT-PCR和Western blot的方法检测转染后细胞Gadd45a mRNA和蛋白的表达。结果:成功构建Gadd45a表达质粒pcDNA3.1-Gadd45a,转染该质粒的Jurkat和正常人CD4+T细胞均显示Gadd45a过表达。结论:Gadd45a表达质粒的构建及诱导其在人T细胞中的过表达为进一步研究Gadd45a在表观遗传学机制中的作用提供了研究基础。

ING4基因的克隆和真核表达载体的构建

目的分离小鼠ING4(inhibitorofgrowthfamily,member4)基因并构建真核表达载体pcDNA3.1(+)ING4。方法从小鼠肝组织中提取总RNA,通过RTPCR扩增出ING4cDNA,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)ING4,分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定。结果RTPCR产物为约750bp的条带,构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)ING4经双酶切、PCR鉴定均出现750bp大小的条带,基因测序正确。结论分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)ING4。

hSAMP32基因疫苗的构建及对小鼠生育的影响

目的构建hSAMP32避孕疫苗,研究其对小鼠生育率的影响。方法扩增hSAMP32基因片段;hSAMP32基因测序;重组质粒pcDNA3.1(+)-hSAMP32的构建;观察BALB/c小鼠生殖能力是否受到影响。结果经对比,目的基因组较对照组穿卵率明显下降。结论 hSAMP32基因可以降低BALB/c小鼠的生殖能力。

Dpc4基因转染胰腺癌细胞株对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的影响

目的探讨Dpc4基因转染胰腺癌细胞株HS766T对裸鼠移植瘤生长的影响。方法按pcDNA3．1-DOe4是否转染人胰腺癌细胞株HS766T将细胞分为pcDNA3．1-Dpc4转染组、pcDNA3．1空载体组和未转染组，RT—PCR鉴定目的基因的表达；将3组细胞分别接种于裸鼠，比较Dpc4基因对裸鼠胰腺癌移植瘤的生长抑制作用，

小鼠淋巴细胞抗原CTLA-4的胞外肽段表达及纯化

目的:真核细胞表达小鼠淋巴细胞抗原CTLA-4胞外段肽,研究表达肽段与抗原呈递细胞B7分子结合后减轻小鼠淋巴细胞刺激后的增殖抑制,从而启动T淋巴细胞进一步增殖。方法:从小鼠脾脏淋巴细胞获得总RNA,通过逆转录PCR扩增出CTLA-4全长基因,克隆并测序。依据胞外段序列和真核表达载体pcDNA3.1序列,合成引物扩增胞外片段,两者经内切核酸酶处理、连接构建重组表达pcDNA3.1载体,重组质粒经测序验证后,采用lipofectamine2000转染入小鼠肝癌细胞Hepa1-6,经G418筛选获得稳定表达细胞株。结果:获得小鼠CTLA-4胞外段真核表达载体和小鼠肝癌细胞Hepa1-6稳定表达转染细胞株,制备了CTLA-4胞外肽段,经His标签抗体和小鼠CTLA-4抗体Westernblot检测表达蛋白带均呈阳性。结论:获得CTLA-4胞外段肽,为进一步研究该肽的作用打下基础。

白细胞介素-4修饰骨肉瘤SAOS-2细胞在SCID小鼠体内基因免疫治疗的研究

骨肉瘤是青少年最常见的恶性骨肿瘤，其恶性度高，转移快，疗效低，是骨科的棘手难题。白细胞介素（IL）-4是一种具有多种生物学调节功能的细胞因子，它对几乎所有从造血干细胞分化衍生来的细胞都有作用。我们应用体外基因重建构建负载IL4的真核表达载体pcDNA3．1，转染骨肉瘤细胞SAOS-2，接种SCID小鼠，观测其对骨肉瘤的成瘤影响。

小鼠Oct4基因真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建小鼠Oct4基因真核表达载体并对其表达进行鉴定。方法:以小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)cDNA为模板克隆Oct4基因编码区序列,将其通过定向克隆插入pcDNA3.1(+)载体多克隆酶切位点(multiple cloning sites,MCS)中,形成pcDNA3.1(+)/Oct4重组载体。将pcDNA3.1(+)空载体和pcDNA3.1(+)/Oct4重组载体分别转染293T细胞,通过Western Blotting检测Oct4蛋白的表达。结果:成功检测到Oct4蛋白的表达。结论:成功构建了小鼠Oct4基因真核表达载体。