膜联蛋白A2质粒的构建及其在膀胱癌pumc-91细胞增殖和迁移中的作用

目的膜联蛋白A2(annexin A2,Anxa2)在多种肿瘤细胞中具有调节生物活性的作用。本研究旨在探讨Anxa2蛋白的表达与膀胱癌pumc-91细胞增殖和迁移的相关性。方法扩增ANXA2序列,插入pcDNA3.1(+)载体,制备pcDNA3.1(+)-ANXA2质粒。用脂质体lipo2000将pcDNA3.1(+)-ANXA2瞬时转染至pumc-91膀胱癌细胞中。Western blotting检测空白组、转染pcDNA3.1(+)空载的对照组和转染pcDNA3.1(+)-ANXA2质粒的实验组中Anxa2蛋白的表达。利用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测pumc-91细胞的增殖能力,transwell实验检测pumc-91细胞的迁移水平。采用单因素方差分析或重复测量的方差分析比较各组间检测数据的差异。结果PcDNA3.1(+)-ANXA2质粒构建成功,测序完全正确。Western blotting检测显示,与空白组和对照组相比,实验组Anxa2蛋白表达水平增高。CCK8实验显示实验组增殖的pumc-91细胞数量相比于空白组(P<0.001)和对照组(P=0.001)明显增多;transwell实验中实验组穿膜的pumc-91细胞数量较空白组(P=0.011)和对照组(P=0.027)也明显增多。结论Anxa2蛋白的表达上调可能在膀胱癌pumc-91细胞增殖和迁移中起重要作用。

过表达UCP3基因对萨湖羊前体脂肪细胞分化的影响

旨在阐明萨湖羊解偶联蛋白3(UCP3)基因的组织、细胞表达模式,阐明过表达UCP3对揭示对萨湖羊前体脂肪细胞分化的影响。本研究通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术检测UCP3基因在3只萨湖羊心脏、肝脏、脾脏等组织中的表达分布及在成脂诱导分化不同时期的表达水平;过表达UCP3后,采用qPCR验证过表达效率;利用油红O染色、脂质提取分析及脂肪细胞分化标志基因的检测,分别从细胞形态学和生物学角度明确过表达UCP3对萨湖羊脂肪细胞脂质生成的影响。结果表明:UCP3基因在萨湖羊各组织中广泛表达,在心脏和脾脏中相对表达量较高;时序表达谱显示,在萨湖羊前体脂肪细胞分化过程中UCP3基因表达量呈上升的趋势(P<0.05);过表达UCP3后,萨湖羊前体脂肪细胞的脂滴明显增多,极显著增加了脂质含量(P<0.01);脂肪细胞分化标志基因PPARγ、C/EBPα、LEP mRNA水平极显著上升(P<0.01),FAS、UCP1 mRNA水平显著上升(P<0.05)。本研究揭示了萨湖羊UCP3的表达模式,验证了过表达UCP3能够促进萨湖羊前体脂肪细胞的成脂分化,推测UCP3是萨湖羊前体脂肪细胞的正调控因子,可能是通过调控PPARγ、C/EBPα和FAS等分化关键基因的表达来实现的。

牛lncRNA SNHG12过表达载体构建

可卡因苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)是一种内源性神经肽类物质,CART广泛存在于牛卵巢中,并且对牛卵泡闭锁产生调节作用。miRNA 491可以靶向结合牛CART基因3′-UTR区域,从而调控mRNA表达极显著下调。通过ENCORI数据库预测发现lncRNA SNHG12可能作为miRNA 491的分子海绵,从而影响牛CART基因的转录调控。本试验通过构建牛lncRNA SNHG12过表达重组载体,为进一步探究lncRNA SNHG12、miRNA 491和牛CART基因三者的互作关系奠定试验基础。结果显示pcDNA3.1-EGFP-SNHG12载体序列检测正确;转染293T细胞转染效果良好。荧光定量PCR结果显示在293T细胞中NC组的lncRNA SNHG12的表达水平极显著高于miRNA 491组,试验表明pcDNA3.1-EGFP-SNHG12载体构建成功,并且lncRNA SNHG12与miRNA491具有互作作用。

牛lncRNA H19过表达载体构建

[目的]构建以及鉴定牛lncRNA H19过表达重组载体,为进一步探究lncRNA H19与miRNA 491和牛CART基因的互作关系奠定试验基础。[方法]NCBI获取牛lncRNA H19序列,经聚合酶链式反应(PCR)扩增,双酶切后载入pcDNA3.1-EGFP载体得到重组质粒。将pcDNA3.1-EGFP-H19、miRNA 491和CART 3种质粒共转染至HEK293T细胞,在细胞内反复扩增过表达之后,利用荧光定量技术检测pcDNA3.1-EGFP-H19的表达量。[结果]结果显示pcDNA3.1-EGFP-H19载体序列正确;293T细胞绿色荧光达50%,且强度适中,说明转染效果良好;lncRNA H19在293T细胞中显著表达。[结论]pcDNA3.1-EGFP-H19载体构建成功,试验将为后续探究lncRNA H19与miRNA 491和CART基因之间的互作关系创造试验条件。

流感病毒血凝素基因HA1区的克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆甲型流感病毒血凝素基因HA1区及构建其真核表达载体。方法 从接种人流感病毒株A/PR/ 8/ 34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA ,用特异引物进行RT PCR ,扩增血凝素基因HA1区。将所扩增片断克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+) ,转化感受态大肠杆菌JM 10 9并筛选阳性克隆。结果 经双酶切、PCR及测序鉴定证实血凝素基因HA1区的真核表达载体构建成功。结论 甲型流感病毒血凝素的HA1区是与宿主细胞膜表面受体结合的部位并起着诱导机体产生保护性抗体的作用 ,HA1区的克隆和其真核表达质粒的构建将为防治病毒侵入宿主细胞及核酸疫苗的研究打下基础。

牛妊娠相关糖蛋白1(bPAG1)的真核表达及纯化

[目的]本研究旨在构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞细胞中转染表达。[方法]通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG1的全基因序列,经T4连接酶将载体PCDNA3.1(-)与酶切bPAG1片段连接,构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组载体后转染到CHO细胞,经SDS-PAGE和Western Blot检测重组牛妊娠相关糖蛋白1(rbPAG1)的表达效果。[结果]PCR扩增得到1218 bp的bPAG1基因片段,构建的重组质粒PCDNA3.1(-)-bPAG1经双酶切获得约5400和1218 bp的2条片段,与预期相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致;SDS-PAGE和Western Blot鉴定显示,获得相对分子质量约为62 kDa的bPAG1重组蛋白,通过Ni柱亲和层析纯化后,rbPAG1纯度可达88%。[结论]本研究为bPAG抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研发奠定了基础。

miR-21真核表达载体的构建及其活性鉴定

目的:构建miR-21的真核表达载体,并使其在骨肉瘤MG63细胞中表达,为研究miR-21对骨肉瘤细胞MG63的作用打下基础。方法:根据miRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共433个碱基序列,设计PCR引物,PCR扩增,退火后用T4连接到线性化的pcDNA3.1(+)质粒中,并对重组质粒进行双酶切、菌落PCR及测序分析,鉴定完全正确的重组质粒转染骨肉瘤细胞MG63,G418(400 mg/L)筛选4周获得miR-21稳定表达细胞系,用Northern blot及real time RT-RCR法鉴定pcDNA3.1(+)-miR-21可在真核细胞中过表达。结果:成功构建了miR-21的真核表达载体,并获得稳定转染重组质粒的细胞系。结论:miR-21的真核表达载体在骨肉瘤细胞MG63中稳定高表达,为进一步研究miR-21在骨肉瘤MG63中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。

蛛网膜下腔注射pcDNA3.1(+)-hPPE对大鼠神经病理性痛的镇痛效应

目的:观察蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE对大鼠神经痛的镇痛作用。方法:SD大鼠随机分为坐骨神经慢性压迫(CCI)组、CCI假手术组、实验组和空质粒组。CCI组和CCI假手术组,用于观察疼痛持续时间;实验组和空质粒组分别于CCI术后第15天蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE和空质粒pcDNA3.1(+)。测定各组注射质粒前后CCI模型鼠双后肢热痛阈(PWTL),观察纳洛酮对镇痛效应的影响,用放射免疫法检测脑脊液灌流液中脑啡肽(L-ENK)的含量,同时采用免疫组织化学方法测定两组大鼠脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体2B亚基(NR2B)表达的变化。结果:CCI术后7～33d,术侧PWTL明显低于对照侧。空质粒组注射前后热痛阈未见明显变化;与空质粒组相比,实验组大鼠蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE后的第3天产生明显的抗伤害效应(PTWL升高),持续镇痛长达18d,且镇痛效应能被纳洛酮翻转。实验组脑脊液灌流液L-ENK含量显著高于空质粒组。与空质粒组比较,实验组大鼠脊髓背角NR2B阳性蛋白表达明显受到抑制。结论:蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE能够减轻大鼠神经病理性疼痛的热痛敏行为。

pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 :构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体 (hTSHR)基因真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :以限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR ,获得hTSHRcDNA的全长片段 ,在以低熔点琼脂糖回收纯化后 ,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点中 ,构建重组体pcDNA3.1/hTSHR ,进行酶切、PCR及测序鉴定。通过脂质体介导 ,转染COS 7细胞进行瞬时表达 ,并用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测hTSHR的表达。结果 :双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR得到约 2 70 0bp含TSHR全长cD NA的片段 ,同预期片段的大小相符。所构建的pcDNA3.1/hT SHR经双酶切及PCR鉴定同预期大小相符 ;测序结果与Gen Bank中收录的hTSHR全长序列一致 ,表明真核表达质粒构建正确。以脂质体转染COS 7细胞后 ,用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测表明 ,细胞可表达hTSHR。结论 :成功地构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/hTSHR ,为进一步研究TSHR的功能 ,以及利用hTSHR真核表达载体建立Graves实验动物模型奠定了基础。

日本血吸虫pcDNA3.1(+)/MLP核酸疫苗的构建及其对家兔保护性免疫作用的研究

目的 体外扩增日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白抗原的部分基因序列 ,构建日本血吸虫pcDNA3 1(+) /MLP核酸疫苗 (SJP) ,免疫新西兰家兔 ,观察它在肌肉组织中的表达、及其对家兔的保护性免疫作用。方法 分子克隆常规操作构建SJP疫苗 ,免疫家兔 ,家兔肌肉组织体外扩增查MLP基因 ,并通过免疫组化观察重组蛋白在局部肌组织中的表达 ;做血清抗体及细胞因子分析 ,计算减虫率及减卵率。结果 经酶切、PCR及测序鉴定表明所构建的SJP中含有目的基因序列 ;免疫家兔 8周后可以在免疫家兔肌肉中检测到MLP基因 ,免疫组化结果阳性 ;可诱导IgA、IgG1及INF -γ变化 ,减虫率为2 4 10 % ,减卵率为 2 8 10 %。结论 成功地构建了含目的基因的核酸疫苗SJP ,SJP免疫家兔后 ,肌组织有重组蛋白的表达 ,并可产生一定的免疫保护性作用。

pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白在大鼠鞘内注射的表达

目的：构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）并观察其存大鼠体内的转染部位及表达时间。方法：构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔，观察其存大鼠体内转染后的时空效应。结果：双酶切结果符合真核表达载体pcDNA3.1（＋）约5.4kb，EGFP约750bp，另外测序分析与文献报道结果完全一致；动物实验结果表明，鞘内注射24h后存大鼠的脑脊膜和脊神经的外膜上有EGFP表达，在14d达到高峰，4周后明显下降，第7周消失；在实验组大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有绿色荧光。对照组所有取材部位均没有绿色荧光。结论：重组质粒pcDNA3.1（＋）-EGFP通过直接注射法被成功转染至大鼠的蛛网膜下腔，且外源基因得到了表达。

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1-polβ的构建

目的 :构建含突变型 polβ基因重组表达载体。 方法 :从食管癌标本中提取总RNA ,反转录合成cDNA ,克隆入 pCDNA3.1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒 ,并进行测序。 结果 :测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论 :成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体 ,可应用于下游研究。

人白细胞介素12双亚基共表达载体的构建及表达

目的 :为了基因治疗研究的需要构建人白细胞介素 12 (hIL 12 )双亚基基因共表达质粒 [(P(+) IL 12 ) ],比较它与单个亚基基因表达质粒 [P(+) P4 0 和P(- ) P35]1∶1共同转染肝癌细胞HepG2后 4 8小时表达结果。方法 :分别克隆hIL 12P4 0 、P35亚基cDNA全长至pcDNA3 1(± )中构建P(+) P4 0 和P(- ) P35,再将两者串联克隆至pcDNA3 1(+)中构建P(+) IL 12。脂质体转染 3种质粒至肝癌细胞HepG2 ,4 8小时后抽取细胞总RNA做半定量RT PCR ,同时取细胞上清做ELISA及Western杂交 ,结果进行比较分析。结果 :两种转染方式均可以表达hIL 12蛋白质且半定量RT PCR显示较未转染组hIL 12的mRNA水平均增加 ;转染后 4 8小时P(+) IL 12组细胞培养上清hIL 12表达量较 [P(+) P4 0 和P(- ) P35]按 1∶1比例共同转染组显著增高(P <0 0 5 )。结论 :人白细胞介素 12双亚基基因串联共表达质粒 [P(+) IL 12 ]能够转入HepG2并表达hIL 12蛋白质 ,并且转染后 4 8小时hIL 12表达量较单个亚基基因表达质粒 [P(+) P4 0 、P(- ) P35]1∶1共转染者显著高。

人MxA基因重组真核载体的构建及鉴定

目的:应用真核载体PcDNA3.1构建含我国健康人目的基因MxA的重组真核载体PcDNA3.1-MxA。方法:在大肠杆菌JM109中扩增前期已构建的含有目的基因MxA的PAdtrack-MxA和真核载体PcDNA3.1,使用两者共同的限制性内切酶XbaⅠ、NotⅠ进行双酶切,并连接以构建重组真核载体PcDNA3.1-MxA,然后通过氨苄青霉素抗性筛选,双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序,并应用DNAssist 2.0软件对序列与前期获得的基因序列以及已知GenBank中MxA基因序列进行同源性分析。结果:经限制性内切酶、PCR鉴定重组真核载体PcDNA3.1-MxA构建成功。测序结果表明本实验所克隆片段长2012bp,包含人MxA基因序列,核苷酸序列分析表明与前期获得的目的基因序列完全相同,而与GenBank中人MxA基因序列同源性也达99.75%,仅有5个碱基不同,且所编码的氨基酸仅1个发生改变,此氨基酸位于MxA蛋白的非功能区。结论:重组真核载体PcDNA3.1-MxA构建成功,为下一步研究MxA抗乙型肝炎病毒作用奠定了基础。

牛双芽巴贝斯虫新疆株HSP20基因的克隆和真核表达质粒的构建

通过设计牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白HSP20基因序列的特异性引物,采用PCR方法从疑似"牛焦虫病"的患牛全血基因组中扩增得到699 bp的HSP20基因,将其连入pMD18-T测序、鉴定,再将验证的699 bp的HSP20基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核载体PCDNA3.1-HSP20。经再次测序、鉴定后,尾静脉注射小白鼠进行HSP20基因的瞬时表达,取其肝脏提取总RNA,经RT-PCR方法扩增出一条534bp的目的条带,表明真核表达质粒构建成功。

小鼠B7-2基因的克隆、测序及其重组质粒的构建

目的 :克隆小鼠 B7- 2基因编码区的 c DNA序列 ,并构建其表达载体。方法 :利用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)法 ,以小鼠脾细胞 m RNA为模板 ,扩增获得 B7- 2基因 ,与 p MD- 1 8T连接做全自动测序 ,并利用基因重组技术构建包含 B7- 2基因的表达质粒 pc DNA3.1 - CMV- B7- 2及 pc DNA3.1 - Egr- B7- 2。结果 :经测序证实获得的 B7- 2基因与文献报道的基本一致 ,并成功地构建了表达质粒。结论 :成功克隆了 B7- 2的编码基因 ,并成功构建了表达载体 pc DNA3.1 - CMV- B7- 2及 pc DNA3.1 - Egr- B7-

人HSP40基因真核表达载体的构建及表达

目的构建人热休克蛋白40(HSP40)的2种同源物HDJ-1和HDJ-2基因真核表达载体,观察其在人成神经细胞瘤细胞株(SK-N-SH)中的表达。方法从流产胚胎脑组织中抽提总RNA,RT-PCR扩增HDJ-1和HDJ-2cDNA,经限制性内切酶双酶切后,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)和pEGFP-N1质粒中。HDJ-1和HDJ-2基因测序结果与基因库登录序列比对,序列正确的重组质粒用脂质体转染SK-N-SH细胞,Western blot和荧光显微镜观察基因表达情况。结果HDJ-1和HDJ-2基因测序结果与基因库登录序列比对显示完全一致。Western blot证实pcDNA3.1(+)/HDJ-1转染SK-N-SH细胞24h后有HDJ-1的过表达,至少持续72h;pEGFP-N1/HDJ-1和pEGFP-N1/HDJ-2转染的细胞有HDJ-1/GFP和HDJ-2/GFP融合蛋白的表达,至少持续72h。荧光显微镜观察到pEGFP-N1/HDJ-1和pEGFP-N1/HDJ-2转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建pcDNA3.1(+)/HDJ-1、pEGFP-N1/HDJ-1和pEGFP-N1/HDJ-2真核表达质粒,并在SK-N-SH细胞中表达。

pcDNA3.1-Egr.1p-p16基因联合放射治疗对裸鼠肿瘤的作用

目的:探讨pcDNA3.1 Egr.1p p16基因联合放射治疗移植人胰腺癌细胞JF 305裸鼠的抗肿瘤作用的 适宜照射剂量和质粒注入量。方法:不同剂量X射线照射(2,10,20Gy)及瘤内不同量脂质体包裹的pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒(10,20,30μg)注入接种JF305胰腺癌细胞的裸鼠体内,测定各组裸鼠体积以观察各种处理抑瘤效 应的差异,并用RT PCR检测放射治疗后48h各组肿瘤局部p16mRNA水平。结果:质粒注入后接受20GyX射线 照射组照射后4～28d,肿瘤生长速率明显低于2Gy和10Gy照射组(P<0.05)。质粒注入量为20μg或30μg的 联合治疗组照射后4～28d,肿瘤生长速率明显低于注入量为10μg的联合治疗组(P<0.05)。单纯接种 pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒组和接种pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒照射组小鼠的肿瘤组织内有p16mRNA表达,且 pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒照射组的p16mRNA水平明显高于单纯pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒组(P<0.05)。结 论:pcDNA3.1 Egr.1p p16基因联合放射治疗小鼠体内抗肿瘤作用的适宜射线照射剂量为20Gy,质粒注入量为20 μg;pcDNA3.1 Egr.1p p16基因联合放射治疗的抗肿瘤作用明显优于单纯放射治疗或单纯基因治疗,这可能与辐射 激活Egr.1p基因后增强抑瘤基因p16的表达有关。

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及血管内皮生长因子表达的影响

目的 构建人骨形成蛋白 - 2 (h BMP- 2 )真核表达载体 pc DNA3.1- h BMP- 2 ,转染人骨髓基质干细胞(MSCs) ,探讨基因转染对其增殖和血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响。 方法 利用重组 DNA和基因克隆技术构建重组载体 pc DNA3.1- h BMP- 2 ;细胞培养和基因转染技术体外转染人 MSCs;免疫细胞化学、原位杂交和蛋白印迹法检测细胞 BMP- 2的表达 ;通过流式细胞仪和 VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖和 VEGF表达的影响。 结果 转染后细胞在 m RNA水平和蛋白质水平均表达 BMP- 2 ;转染后 S期细胞比例增多 ,提示细胞 DNA的合成增加 ;BMP- 2基因转染上调细胞 VEGF的表达。 结论 在脂质体介导下 ,pc DNA3.1- h BMP- 2转染 MSCs获得成功。基因转染后能促进细胞增殖并将通过使 VEGF的表达增加促进血管再生 ,为进一步骨缺损的基因治疗及构建组织工程骨奠定了实验基础。

转化生长因子β2真核表达载体pcDNA3.1(+)/TGF-β2的构建及其在骨髓基质细胞的表达

目的 :构建人转化生长因子 β2的真核表达载体 pcDNA3.1(+) /TGF - β2 ,检测其转染骨髓基质细胞后的表达。方法 :用PCR方法从人胎盘cDNA文库DNA中扩增TGF - β2全长cDNA ,该基因片段两端设计了NheⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将TGF - β2的cDNA构建到真核表达载体 pcDNA3.1(+)上 ,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术 ,将所构建的载体导入从骨髓中分离培养的基质细胞中 ,体外单层培养。分别于转染后 2 4h和 4周利用RT -PCR和Western -Blotting方法检测目的基因的表达情况。结果 :经琼脂糖凝胶电泳及测序证实 ,PCR获得的片段与GenBank中登记的TGF - β2cDNA序列完全相同。pcDNA3.1(+) /TGF - β2酶切片段的长度与理论大小相符。转染后不同时期的骨髓基质细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到TGF - β2的表达。结论 :pcDNA3.1(+) /TGF - β2真核表达载体构建成功 。