猪METTL3基因生物信息学分析及靶基因预测

[目的]获得猪METTL3蛋白理化性质、二、三级结构、蛋白保守性、甲基化位点及靶基因等信息,为进一步了解猪METTL3基因的功能提供了理论依据。[方法]利用生物信息学软件对猪METTL3蛋白质的理化性质、二、三级结构及保守结构域、甲基化位点、蛋白互作和靶基因等进行预测分析。[结果]猪METTL3为亲水性不稳定蛋白,主要由无规卷曲和α-螺旋、β-转角构成,主要存在于细胞核中,与METTL14、WTAP和POLR2B等蛋白具有互作关系。METTL3有4个高可信度m^(6)A位点,经M6A2 Target软件预测该基因与CASP1、PYCR1、RANBP2、LIRB4、APOBEC3A、ADAM19等134个基因存在靶向关系。[结论]猪METTL3是一种主要存在于细胞核中的亲水性不稳定蛋白,主要通过m^(6)A甲基化修饰作用于靶基因而发挥作用。

哺乳动物细胞表达人细胞珠蛋白

[目的]构建带His标签的人细胞珠蛋白(cytoglobin,CYGB)哺乳细胞表达载体,转染CHO细胞和HEK293细胞表达CYGB。[方法]采用全基因合成并通过双酶切法将CYGB基因插入到表达载体pcDNA3.4中,经双酶切和测序验证后转染大肠埃希菌DH5α菌株,提取转染级质粒并转染哺乳动物细胞CHO和HEK293,进行瞬时表达,镍柱亲和层析纯化CYGB蛋白。纯化的CYGB蛋白采用Western Blotting法和ELISA法检测蛋白活性。[结果]双酶切和琼脂糖凝胶分析结果表明,pcDNA3.4-His-CYGB真核表达质粒构建成功。CHO细胞瞬时转染pcDNA3.4-His-CYGB真核表达质粒后CYGB表达量较低,HEK293细胞表达量较高,最终采用HEK293细胞进行CYGB表达。SDS-PAGE法检测结果表明CYGB蛋白的分子量约为22 kDa,分子量符合预期。镍柱亲和层析纯化的CYGB的Western Blotting和ELISA检测结果表明HEK293细胞表达的CYGB与抗CYGB单克隆抗体具有生物学结合活性。[结论]HEK293细胞比CHO细胞更适合用于CYGB的哺乳动物细胞表达,其表达的CYGB具有Western Blotting和ELISA生物学活性。