小鼠T-bet基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T—bet基因重组真核表达载体pcDNA3一T—bet,为T—bet基因治疗研究提供有效的生物表达系统。方法采用内切酶切从质粒T—bet/GFP—RV中获得约1.7 kb的小鼠T—betcDNA片段,以单酶切非定向克隆方式与真核表达质粒pcDNA3连接,构建真核表达载体pcDNA3-T-bet。结果经PCR筛选阳性重组子,双酶切鉴定T—bet基因重组方向,并测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变。结论本实验成功构建了小鼠T—bet基因真核表达载体pcDNA3-T-bet。

小鼠IL-4真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-4(murine interleukin-4,mIL-4)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠IL-4基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,利用电泳和测序鉴定重组质粒的大小、序列。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-4转入293T细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其表达。结果经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-4构建成功,并在293T细胞中成功表达。结论 pcDNA3.0-mIL-4可在真核细胞中成功表达,为进一步研究其在炎症性肠病(IBD)动物模型中的生物学功能提供了条件。

日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjSDISP的安全性评价

目的评价日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjSDISP的安全性。方法同体左右侧自身对比法对3只家兔进行局部肌肉刺激实验,22只豚鼠随机分为4组:A组为无菌生理盐水阴性对照组,B组为牛血清白蛋白阳性对照组,C组为pcDNA3/SjSDISP低剂量组,D组为pcDNA3/SjSDISP高剂量组,进行全身过敏实验。结果日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjSDISP对家兔局部肌肉刺激反应轻微,对豚鼠无全身过敏反应。结论日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjSDISP在该实验条件下安全。

脂质体法pcDNA3-ELAC2质粒转染乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231以及前列腺癌细胞Du-145

目的:构建稳定、高效表达ELAC2基因的乳腺癌细胞模型MCF-7/ELAC2、MDA-MB-231/ELAC2,以及前列腺癌细胞模型Du-145/ELAC2,为探索ELAC2基因的生物学功能奠定实验基础。方法:将构建pcDNA3-ELAC2的质粒采用脂质体法转染乳腺癌细胞和前列腺癌细胞,用RT-PCR和WesternBlot分别检测ELAC2基因在细胞中的mRNA表达和蛋白表达。结果:pcDNA3-ELAC2质粒构建成功并顺利导入乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中,且检测到ELAC2基因的mRNA和蛋白高表达。结论:构建的pcDNA3-ELAC2重组质粒能够在转染的乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中稳定、持续和高效地表达,为进一步研究ELAC2基因的生物学功能提供了理想的实验模型。

GFP基因真核表达质粒的构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的克隆绿色荧光蛋白(GFP)基因并构建真核表达载体,观察其在人胚肾293(下称293细胞)细胞中的表达和分布,为制备自行设计的以λ噬菌体为载体的人类免疫缺陷病毒(HIV)核酸疫苗的阳性对照奠定基础。方法以克隆好的pUC18/GFP为模板,根据Genbank中GFP的核苷酸序列设计引物,并在引物的5′端分别引入BamH及Xho酶切位点,特异性扩增GFP基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含GFP编码基因的真核表达载体,酶切鉴定分析后,将该重组质粒通过脂质体介导,转染293细胞。荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达和分布。结果重组质粒经BamH、Xho双酶切成5.4kb与0.7kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了GFP基因片断,测序结果表明编码框正确,并在293细胞中获得了表达,分布均匀。结论pcDNA3.1(+)/GFP真核表达载体已成功构建,并可在293细胞中表达。