不同激素对花生离体分化的影响

对TDZ和 2 ,4 D等激素在花生成熟胚外植体分化中的影响进行了研究。结果表明 ,花生成熟胚 3～ 5d龄实生苗的幼叶和胚轴在低浓度TDZ的诱导下 ,可分化产生高频不定芽和少量体细胞胚 ,转到无激素MS培养基或MS +BA 0 .5mg/L+NAA 0 .4mg/L的培养基后形成丛生苗。丛生苗分离后转入含 1 /2MS(大量元素 ) +IBA 0 .4mg/L的培养基中诱导生根 ,可形成完整的再生植株。幼叶分化率高于胚轴 ,但胚轴分化成苗速度快。无菌水浸泡 1 6～ 2 4h的胚轴在 5～30mg/L2 ,4 D的诱导下 ,分化产生低频不定芽 ;而胚叶则产生高频体细胞胚 。

低能钒离子注入花生种子的深度分布

采用卢瑟福背散射(RBS)和X射线能谱分析法(EDAX)对V元素在花生种子中的深度分布进行了测量 ,并用扫描电镜对注入前后花生种胚的形貌变化进行观察。结果表明 ,由于样品表面较粗糙以及其特殊结构 ,RBS方法不适于测量钒在花生种胚中的深度分布 ,trim95也不适合于对注入钒离子在花生种子中的深度进行模拟 ,而EDAX的测量结果表明V离子的穿透深度可达到15μm。另外 ,注入前后花生种胚的形貌发生了显著变化。

花生体细胞胚的诱导及其植株再生

采用不同成熟度的花生胚轴为外植体进行体细胞胚诱导及植株再生研究，结果表明，成熟胚轴在高浓度2，4－D的MS培养基中，经过30d左右的培养，可直接诱导产生出大量的体细胞胚，含40mgL~－12，4－D的培养基中体细胞胚的诱导率达100％，平均每个外植体产生11．58个体细胞胚．体细胞胚的继代培养需降低2，4－D的浓度（1－20mgL~－1）．未成熟胚轴的体细胞胚诱导及继代培养的2，4－D浓度宜为10mgL~－1．将诱导的体细胞胚转接到合5－10mgL~－1BA的MS培养基中，体细胞胚能够萌发再生成无根小植株，将其转接到生根培养基中可获得完整小植株．

Au离子注入花生种胚深度的研究

使用金属蒸汽真空弧离子源 (MEVVA源 )离子注入机对花生种胚进行Au离子的注入 ,采用卢瑟福背散射 (RBS)和X射线能谱分析 (EDAX)法测量Au元素在花生种子中的深度分布 ,并观察注入前后的样品形貌。结果表明 ,由于样品表面粗糙 ,RBS不适于测量Au元素在花生种子中的浓度分布 ,而EDAX的测量则显示Au元素在花生种子中的最大穿透深度可达 15 μm。另外 ,本文还讨论了离子注入的诱变机理。

花生体细胞胚发生发育过程中淀粉代谢的动态变化

将花生实生苗的幼对接种于MS固体诱导培养基上诱导体细胞胚发生 ,用PAS染色法观察了体细胞胚发生发育过程中的淀粉代谢的动态变化 .结果表明 ,在体细胞胚的发育过程中 ,淀粉表现出两次积累高峰 ,第一次在胚性细胞团中 ,淀粉粒大而密集 ;随着胚性细胞的分裂 ,淀粉逐渐被消耗 ,到多细胞原胚期胚体内淀粉趋于消失 .球形胚期 ,淀粉粒又开始积累 ,出现第二次积累高峰 ;到成熟胚期 。

不同成熟度花生胚萌发时子叶中贮藏蛋白质的降解

花生(Arachis hypogaea L.)汕油71果针入土20d(20 DAP)的种子剥去种皮后,10％的胚可以萌发,至40 DAP发芽率达98％。不同发育时期的花生胚萌发 10d后子叶盐溶蛋白质和花生球蛋白降解表明,20和32 DAP胚萌发后,子叶中这些蛋白质只有部分降解。随着胚成熟度增加,子叶中降解这些蛋白质的能力不断提高。20～40 DAP胚萌发4d时,子叶的BAPAase和GHE活性较低。50～80DAP胚萌发 4d,子叶中上述两种酶均显示较高的活性。

花生去子叶幼胚的丛生芽诱导和植株再生

授粉后２５－３０天的花生幼胚，去子叶后，在ＭＳ２（ＭＳ＋ＢＡ１．０ｍｇ／Ｌ＋ＣＨ３００ｍｇ／Ｌ＋ＰＶＰＰ０．３％＋椰计５０ｍｌ／Ｌ＋蔗糖４％＋琼脂０．８％）培养基中，置３００ｌｕｘ弱光和２０℃±１℃条件下，培养２１－２８天，能有效地产生丛生芽；在ＭＳ２中诱导培养后的去子叶幼胚的生长点切去，在改良无激素培养基（ＭＳ１）中培养１４天，转入ＭＳ３（ＭＳ＋ＢＡ６．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．４ｍｌ／Ｌ＋Ｄ－生物素０．１ｍｇ／Ｌ＋ＣＨ３００ｍｇ／Ｌ＋酵母浸出物２００ｍｇ／Ｌ＋椰计５０ｍ／Ｌ＋ＰＶＰＰ０．３％＋蔗糖２．５％＋琼脂０．８％）培养基，置２５℃±１℃，３５００ｌｕｘ光照条件下培养２１－２８天，８０％的外植体分化出丛生芽，继而长成无根带叶小苗．．平均每外植体产生８．１个丛生芽，最多可达４０个．诱根后小苗移植田间８０％植株成活并开花结实。品种（系）间差异不显著。

花生成熟胚叶体细胞胚形成过程中的过氧化物酶同工酶研究

以花生成熟胚的幼叶做外植体诱导体细胞胚发生．从外植体培养到子叶胚形成期间，可溶性蛋白浓度初期下降，以后相对稳定；过氧化物酶活性逐渐升高，过氧化物同工酶谱带由２条陆续增加到１０条，球形胚形成以后同工酶谱带不再变化．

花生种子老化相关蛋白质的初步研究

本文以粤油 116花生(Arachis hypogaea L.)为材料,对不同处理种子的除子叶“种胚”(以下简称“种胚”)的蛋白质进行了研究.实验结果表明,当花生种子活力下降到一定程度时,其“种胚”内出现一种新蛋白质( pI6.2、MW 10 KD),随种子老化程度加深,含量逐渐增多.我们认为该蛋白质与花生种子老化存在着一定的相关关系,可作为该种子老化的标志.

花生体细胞胚诱导及植株再生研究

为了建立花生体细胞胚诱导及植株再生体系,为花生分子育种提供技术支撑,以花生品种‘桂花30’和‘桂花771’为材料,采用预培养3天的种子胚小叶、下胚轴、子叶节为外植体,在添加外源激素的MS培养基中使体细胞脱分化形成体细胞胚,再分化成植株。结果表明,在所设定2,4-D浓度(3,5,10,15,20mg/L)范围内,胚小叶最容易诱导形成体细胞胚,2,4-D的适宜浓度为10mg/L,经过约30天培养,可产生大量体细胞胚,‘桂花30’和‘桂花771’的平均诱导率分别为55.37%和36.72%。平均每个外植体产胚量分别为5.68个和4.27个。将诱导形成的体细胞胚转接到6-BA浓度由5mg/L逐渐降低到1.5mg/L的MS培养基中,体细胞胚萌发再生成无根小苗,正常植株再生率‘桂花30’为32.6%,‘桂花771’为23.5%。将无根苗转接到生根培养基中可获得完整植株。花生是较难诱导体细胞胚形成的作物之一,筛选合适的基因型、外植体和激素浓度是获得较高体细胞胚发生率和植株再生率的关键技术。

花生幼叶组织培养及有效植株再生

以花生品种白沙果成熟种胚发芽7d的幼叶为外植体,对花生体细胞胚胎发生和植株再生进行了研究,并建立了其高效再生体系。将幼叶切成1mm×1mm,接种在添加1～3mg/L2,4-D和1～5mg/LBAP的MS培养基上进行培养,获得了高频率的胚胎发生丛(89%～96%)。将带有胚胎发生丛的愈伤组织分别转移至添加10mg/LBAP或添加3mg/LBAP和1mg/LABA的MS培养基上进行培养,57%～100%的胚胎发生丛产生体细胞胚(简称体胚);当将其进一步转移至添加3mg/LBAP和1mg/LABA或添加BAP(4,10mg/L)的MS培养基上进行培养时,体胚萌发,再生植株。植株再生率最高可达96%。

胚中段为外植体的花生高效再生体系构建研究

参考幼叶、子叶为外植体诱导丛生芽的方法,利用花生种子胚生长旺盛的特性,以花生种子胚中段为外植体材料建立一个新植株再生体系。结果表明,在含3.0mg/L的6-BA的MS培养基上,培养30d可以诱导出丛生芽,诱导率达到92.5%;丛生芽转至1/2MS+0.2mg/LIBA+0.1mg/LNAA的培养基中培养2～3周,生根形成完整植株。

2,4-D浓度对花生体细胞胚发生的影响

选用丰花2号、鲁花11和农大818三个花生品种的胚小叶为外植体,在MSB培养基中分别添加不同浓度的2,4-D(1、5、10、15、20mgL)作为诱导培养基,以MSB为继代培养基,研究2,4-D浓度对花生体细胞胚胎发生的影响。结果表明:2,4-D浓度对花生胚小叶脱分化及再分化有显著影响,低浓度的2,4-D对外植体脱分化有利,而较高浓度对再分化有利,诱导体细胞胚的最适2,4-D浓度为15mgL。不同品种的体细胞胚诱导频率存在差异,丰花2号和农大818比鲁花11的体细胞胚诱导频率高;且丰花2号的成苗能力较强,在MSB培养基上即可成苗,鲁花11及农大818成苗能力较差。

平阳霉素对花生体细胞胚胎发生的影响

本文对花生离体培养高频率体细胞胚(体胚)诱导方法,及平阳霉素(PYM)对体胚发生的抑制作用进行了研究,旨在为以PYM作为化学诱变剂进行花生离体诱变提供有效方法。以花生品种花育20号和花育22号成熟种子的胚小叶为外植体,在添加不同浓度2,4-D(0,5,10,15,20mg/L)的MSB5(MS无机盐+B5有机成分)培养基上诱导体胚培养。结果表明:当24,-D浓度为10mg/L时,体胚诱导率高,极显著高于其他处理(除花育20号添加10mg/L与5mg/L无极显著差异),花育20号和花育22号体胚诱导率分别高达80.1%和92.9%。将形成体胚的外植体转接到添加4mg/L BAP的体胚萌发培养基上,成苗率达85%以上。以此培养方法为基础,在诱导培养基中添加不同浓度的PYM(0,1,2,3,4,5mg/L),进行体胚的诱导。结果显示:PYM对体胚发生有显著的抑制作用,随着平阳霉素浓度的增大,体胚诱导率显著下降,外植体褐化率急剧上升。2个供试品种的PYM抑制浓度不同,综合褐化率和体胚形成率,确定花育20号和花育22号适宜的PYM离体诱变浓度分别为3～4mg/L和4～5mg/L,诱变培养时间为30d。

ABA对花生胚离体发育的调节

实验结果表明，ＡＢＡ使花生离休胚处于胚性状态、抑制早萌并继续发育，ＡＢＡ的作用与其浓度有关。ＡＢＡ促进贮藏蛋白的合成，这种调控作用与胚的发育阶段有关。ＡＢＡ也促进了花生胚热稳定蛋白的合成和累积．

花生再生体系的建立

取4d龄花生（鲁花14）的胚轴、小叶和成熟子叶为外植体，对其进行离体组织培养研究。结果表明：在培养1个月后，胚轴在MS＋8．0mg／L6-BA＋1．0mg／LNAA培养基上可以诱导产生丛生芽，诱导率达到80％，平均每个外植体可以产生10～20个芽点；小叶在MS＋5．0mg／L6-BA＋1．0mg／LNAA培养基上能诱导出胚性愈伤组织，进一步诱导分化形成芽点并伸长；诱导出的丛生芽接种在MS＋5mg／L6-BA＋1．0mg／LNAA＋50．0mg／LAD的培养基上可以扩繁和伸长；花生成熟种子的子叶在MS＋20mg／L2，4D＋1．0mg／LKT＋1．0mg／L AgNO3培养基上可直接诱导形成颗粒状、表面光滑、干燥的体细胞胚，每个外植体可以诱导出8个左右的体细胞胚。

发育中花生胚离体萌发和蛋白酶活性变化及脱落酸的影响

发育过程中花生胚氨肽醇有两个活性高峰，与贮藏蛋白质的两个合成高峰相吻合，发育晚期有微弱的羧肽酶活性出现，脱落酸能抑制离体胚萌发，抑制内肽酶和羧肽酶活性，但不抑制氨肽酶活性。发育早期离体胚萌发时贮藏蛋白质降解依赖于羧肽酶、Ａｃｔ－Ｄ和ＣＨＭ处理结果表明羧肽酸在成熟胚已预存但活性处于抑制状态。

三种花生幼胚蛋白质提取方法比较研究

植物组织(或细胞)的蛋白质提取效率与效果直接影响蛋白质双向凝胶电泳等实验的结果。为探索建立适用于花生幼胚蛋白质(双向凝胶电泳用)提取的最佳条件,尝试了磷酸缓冲液直接提取法、改良的荔枝胚胎蛋白提取法和Trizol(附加)提取法等3种提取方法,根据蛋白提取得率、试剂成本、双向电泳图谱的质量(蛋白质斑点的丰度、分布特点)进行初步评价。结果表明,磷酸缓冲液直接提取法简单但总体效果较差,改良的荔枝胚胎蛋白提取法综合评价最好,与双向凝胶电泳条件更兼容。

花生幼胚蛋白质双向电泳的方法与改进

在对传统的双向电泳方法进行改进和优化的基础上,探索适合花生早期幼胚蛋白质双向电泳的方法与体系;利用该方法经考染后能稳定得到100～200个分散性较好的蛋白质斑点,分子量多集中在20 000～90 000之间.还对一些技术细节进行讨论和分析.

钙影响花生胚胎发育/败育特异蛋白质的筛选与鉴定

花生(Arachis hypogaea L.)缺钙造成严重空荚(胚胎败育),导致减产、降质,长期困扰南方花生生产。以大田足(施足钙)、缺(缺钙地大田本底)钙条件下花生的种植与观察为基础,利用改良的传统双向电泳、MALDI-TOF质谱和蛋白质数据库等手段,得到7个与受钙影响花生早期胚胎败育/发育有关的差异表达蛋白。4#差异蛋白是与菠菜(Spinaciaoleracea)的70 kD的叶绿体被膜休克相关蛋白高度相似的缺钙组表达上调的特异蛋白;6#差异蛋白与三叶胶(Heveabrasiliensis)的线粒体前体中ATP合酶的β链高度相似,该蛋白在缺钙幼胚缺失;7#差异蛋白在低钙组缺失,其与马铃薯(Solanum tuberosum)的肌动蛋白97或100类似。研究结果提示,受钙胁迫花生幼胚败育可能与早期幼胚内能量转化、氧化还原系统、细胞内膜以及细胞骨架功能维持相关的功能基因的表达异常有关。初步揭示了受钙影响花生胚胎败育的分子机理。