从家蚕蛾中分离的微孢子虫MZ_1(Nosema sp.)对家蚕的病原性研究

从养蚕生产的蚕蛾中分离到一种小型微孢子虫 ,暂名MZ1,其形状为卵圆形 ,大小为 2 49± 0 10 μm×1 32± 0 12 μm。寄生家蚕的大多数组织器官 ,在蚕体内的生殖发育圈与N .bombycis相似。对家蚕的致病力弱 ,ID50为每条蚕 172 5 0粒孢子 ,能在蚕体内经胚种传染给下一代。MZ1具有Nosema属的分类特征 ,初步定为Nosemasp .。

家蚕新病原性微孢子虫(Nosema SP)的研究

1990年秋从四川省阆中蚕种场种茧育家蚕(Bombyx mori)幼虫分离出一种不同于家蚕微粒子孢子(Nosema bombycis)的新病原性微孢子虫(Nosema SP)。该微孢子虫对蚕的寄生性强,侵染蚕幼虫的绢丝腺、马氏管、肌肉、脂肪体及中肠等组织。孢子为卵圆形,大小3.8～4.1×2.4～2.6μm,极丝长126±8.35μm(113～140μm),在抱予形成期产孢体(7～9×3～4μm),以二裂形成两个孢子母细胞。极丝一般为单层绕成14～15圈(偶有16圈),倾斜角40°以上。

模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术研究

家蚕微粒子病病原为桑蚕微孢子虫(Nosema bombycis Nageli, N.b)。本文根据文献报道,选用了一对根据N.b孢子及其相近种属微孢子虫的SSU-rRNA保守区段设计的有效引物VIF/530R,从模拟感染不同浓度N.b孢子(3×101-7/ml)的蚕蛾、蚕卵的角度,较系统地研究了PCR诊断技术的可检测灵敏度和对模拟感染家蚕微粒子病的诊断效果,为PCR分子诊断家蚕微粒子病的实用化研究提供参考。在本实验的DNA制备方法和PCR反应条件下,分别对由不同浓度N.b纯孢子抽提的DNA模板和不同浓度N.b纯孢子(3×101～7ml-1)分别与蚕卵、蚕蛾混合抽提的DNA模板进行PCR扩增检测。结果表明:(1)对N.b纯孢子DNA模板,PCR可检测灵敏度为3×104N.bml-1(弱检测信号可到3102～3N.bml-1),对模拟染毒N.b孢子的蚕蛾DNA模板,PCR可检测灵敏度为3×105N.bml-1,两者分别已超过或达到目前生产上用显微镜的检毒水平;(2)对模拟染毒N.b孢子的蚕卵DNA模板,VIF/530R引物不能有效地检出蚕卵中染毒的N.b孢子DNA信号,推测在蚕卵DNA抽提物里可能含有抑制PCR扩增的未明因素,而蚕蛾DNA抽提物里则无此抑制因素。

应用PCR技术检测柞蚕微孢子虫

采用斑迹抽提法提取柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)基因组DNA,基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱中有大小约15kb的清晰、完整条带。选用已报道的微粒子属16S rRNA基因的保守序列设计P1/P2和N1/N22对引物,对柞蚕微孢子虫基因组DNA进行PCR扩增,结果2对引物分别扩增出1条大小不同的特异谱条带,其中用引物N1/N2扩增可检测出0.47ng的DNA模板。应用同样的PCR引物、体系和反应条件,可有效扩增出受感染柞蚕幼虫、成虫中的微孢子虫基因组DNA条带。该项检测技术有望应用于柞蚕微粒子病的早期诊断。

基于EB1基因的环介导等温扩增(LAMP)法检测感染家蚕微粒子病的蚕卵

【目的】家蚕Bombyx mori微粒子病一直影响着蚕种业的健康发展,快速而准确地检测出寄生于蚕卵中的家蚕微孢子虫Nosema bombycis对于有效控制家蚕微粒子病危害意义重大。【方法】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法是一种快速、灵敏、特异的DNA体外恒温扩增方法,本文基于LAMP检测法的原理,依据家蚕微孢子虫孢子繁殖复制相关的EB1基因(Gen Bank登录号:KF421134.1)设计LAMP引物,对LAMP反应体系的最佳反应温度、内外引物浓度比、检测反应的特异性、灵敏度等进行研究,建立了一种检测蚕卵感染家蚕微粒子病的LAMP检测方法。【结果】结果表明,基于EB1基因建立的LAMP检测方法在63℃恒温下在1.5 h内就可完成对样品的有效检测,本LAMP法对家蚕微孢子虫孢子DNA的检测灵敏度为5.0×10-3ng/μL,对EB1-p MDTM19-T质粒标准品的检测灵敏度为1.0×102copies/μL,同时对人工感染家蚕微粒子病单个母蛾产下蚕卵的1/8卵圈量或1粒蚕卵均能检出阳性结果。上述结果都分别应用凝胶电泳法、恒温荧光检测仪以及SYBR GreenⅠ显色肉眼观察法得到同步判定。【结论】本研究建立的基于EB1基因LAMP法可用于蚕卵微粒子病的检测,LAMP法为蚕种质量检验及成品卵微粒子病现场检疫提供了新技术。

家蚕微粒子病防控技术研究的发展现状与趋势

家蚕微粒子病是养蚕业的毁灭性病害之一。对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)进入饲养家蚕群体的路径、在家蚕个体内繁殖扩散和在饲养家蚕群体中的扩散规律3个方面的研究进展,以及与此相关的家蚕微粒子病防控技术的发展进行了概述。提出在防止家蚕微孢子虫进入饲养家蚕群体方面,必须根据生产实际并掌握病害流行规律构建因地制宜的防控技术体系;在家蚕个体抗病能力提升方面,家蚕微孢子虫与家蚕的互作机制解明,新型育种技术和微生态技术的应用等非常值得期待;在控制微粒子病在家蚕群体中扩散方面,解明感染个体在蚕座内传播的基本规律,构建新型检疫体系与研发检测技术是迫切需要解决的关键问题。

槐尺蠖和银纹夜蛾寄生微孢子虫三新种记述

本文记述了微孢子虫3新种。槐尺蠖微粒子虫Nosema semiothisae sp. nov.,自然寄主:槐尺蠖Semiothisa cinerearia Bremer & Grey,实验寄主:9种鳞翅目昆虫;银纹夜蛾微粒子虫N. agnatae sp. nov., 自然寄主:银纹夜蛾Argyrogramma agnata(Staudinger),实验寄主:15种鳞翅目昆虫;银纹夜蛾八孢虫Microsporidium argyrogrammi sp. nov., 自然寄主:银纹夜蛾。除描述了它们光镜与电镜形态特征之外,并与近似种比较,作了简短讨论。

甜菜夜蛾微孢子虫研究:Ⅳ.孢子挤出器的超微结构

从甜菜夜蛾幼虫体内首次分离到一种侵染寄主脂肪体、马氏管和中肠 ,对甜菜夜蛾有很强致病力的微孢子虫 ,该微孢子虫新鲜孢子呈椭圆形 ,大小为 ( 3 98± 0 4 3 ) μm× ( 1 65± 0 3 3 ) μm (n =5 0 )。扫描电镜观察发现 ,孢子表面光滑 ,大小基本均匀一致。用透射电镜观察该微孢子虫孢子挤出器的超微结构 ,结果表明 :孢子的挤出器由极体、极丝及相关细胞器和后液泡三部分组成。极体位于孢子前端 ,约占据孢子 2 5 %～ 3 0 %的空间 ,由明暗相间、互相堆叠的片层结构所组成。纵切面上 ,极丝 11～ 13圈 ,单层螺旋状盘绕于孢子后端、孢原质的外层 ,如此典型的极丝切面在同类研究中尚未见报导。横切面上 ,可见极丝为同心管状结构 ,管壁由 6层明暗相间的同心层组成 ,极丝直径约 88 2～ 94 1nm ,极丝倾角在前端约为 5 5°～ 60° ,后端约 65°～ 70°。后液泡位于孢子后端 ,呈椭圆形 ,被一层膜结构包围 ,内含不规则颗粒状的内含体。此外 ,含有 1个极丝圈的初期孢子被发现。研究结果提示 ,在微粒子属 (Nosema)中 ,极丝的圈数、排列方式、极丝倾角的大小及微孢子虫在宿主细胞中的寄生部位等在微孢子虫种间存在着较大的差异 ,而在种内则相对稳定 ,这些超微结构水平上的形态学属性对微孢子虫种的鉴定具有重要价?

家蚕微粒子病显微镜判别时期的探讨

研究了显微镜检出蚕微粒子病的时期与微孢子虫感染剂量、感染蚕龄和所取样本的关系⒚结果表明，蚁蚕和２ 龄起蚕感染高剂量微孢子虫时，能在当龄镜检出孢子，感染低剂量微孢子虫时，可在次龄或以后镜检出孢子⒚从感染蚕中肠、粪便和蚕整体中镜检出孢子的时期，随微孢子虫感染剂量增大和感染蚕龄降低而提早，并且镜检出的时期从先到后分别为病蚕中肠。

基于GC-MS代谢组学解析阿苯达唑治疗家蚕微粒子病的作用机制

【目的】利用GC-MS代谢组学技术研究阿苯达唑对患微粒子病家蚕血淋巴代谢物的影响,从代谢组学角度阐明阿苯达唑的作用机制,为以阿苯达唑为主剂研发新的家蚕微粒子病治疗药物提供理论依据。【方法】对五龄起蚕接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,N.b)建立家蚕微粒子病模型,分别于攻毒后12、24、48、72和96 h开始饲喂阿苯达唑混悬液处理桑叶直至上蔟结茧,以未攻毒未给药的家蚕为对照,待化蛹后逐头镜检调查家蚕感染率,以评价阿苯达唑的治疗效果;同时采用GC-MS代谢组学技术进行非靶向代谢组学研究,筛选患微粒子病蚕体血淋巴中的差异代谢物,并通过MetaboAnalyst 4.0进行代谢通路分析。【结果】阿苯达唑对家蚕微粒子病具有显著的治疗效果,药物作用的关键时间是攻毒后24~48 h。与对照组家蚕血淋巴相比,从模型组家蚕血淋巴中共筛选并定性获得47种差异代谢物,其中27种代谢物呈下降趋势、20种代谢物呈上升趋势。对模型组与阿苯达唑给药组的家蚕血淋巴样本进行比较分析,结果发现除木酮糖、D-葡萄糖-6-磷酸、肌醇、泛酸、甲基丁二酸和油酸外,阿苯达唑对多数与家蚕微粒子病相关的代谢物具有干预调节作用。通过MetaboAnalyst 4.0进行通路分析,发现家蚕感染N.b后有6条主要的代谢通路发生明显变化,分别为:①淀粉和蔗糖代谢;②苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成;③苯丙氨酸代谢;④甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;⑤谷胱甘肽代谢;⑥磷酸肌醇代谢。家蚕添食阿苯达唑混悬液处理桑叶后能有效减轻上述代谢通路的改变,从而促使患微粒子病家蚕处于较正常的生理状态。【结论】阿苯达唑对家蚕微粒子病具有显著的治疗效果,药物作用的关键时间在N.b感染后24~48 h,结合N.b的生活史,可全面揭示阿苯达唑治疗家蚕微粒子病的作用机制,即阿苯达唑通过抑制N.b在蚕体内的裂殖体增殖,有效降低N.b感染对家蚕氨基酸代谢和能量代谢的破坏作用,维持家蚕的正常生理状态,而达到治疗效果。

大微孢子虫对家蚕致病性研究

本文报道了四川发现的大微孢子虫对家蚕的致病性研究结果。试验证明,大微孢子虫可以感染家蚕,但比家蚕微粒子孢子虫(N.b)感染率极显著降低。大微孢子虫带病蚕卵镜检调查,平均感染率为1.79％,家蚕微粒子孢子虫(N.b)带病种卵平均感染率为94.56％,经F测验和新复极差多重比较,大微孢子虫胚种传染率极显著地低于家蚕微粒子孢子虫(N.b)胚种传染率。

不同DNA抽提方法对普通PCR和实时荧光定量PCR方法检测家蚕微孢子虫的影响

为了优选快速、灵敏、特异的家蚕微孢子虫Nosema bombycis分子检测方法和DNA抽提方法,本文通过对家蚕微孢子虫TaqMan探针荧光定量PCR检测方法和SYBRGreen荧光定量PCR检测方法的建立以及反应体系优化,并与普通PCR方法进行比较;再采用4种不同DNA抽提方法分别对PCR和实时荧光定量PCR方法检测家蚕微孢子虫悬浮液的效果评价。结果显示:不经过DNA抽提,直接将家蚕微孢子虫发芽液进行PCR反应的效果优于其他方法,检测灵敏度由高到低依次为直接法、酚/氯仿抽提法、动物组织DNA试剂盒抽提法和植物组织DNA试剂盒抽提法;TaqMan探针法检测家蚕微孢子虫发芽液的灵敏度和SYBRGreen法相近,达到微孢子102个/mL,两者均优于普通PCR方法。实验表明,直接采用发芽液结合荧光定量PCR方法检测家蚕微孢子虫最为简便、快速、灵敏。该研究结果将有助于提高家蚕微粒子病监控技术和检疫能力,对家蚕微粒子病的检疫和防治具有积极意义。

四种de novo组装软件对柞蚕微孢子虫全基因组组装结果的比较

柞蚕是一类以柞树叶为食料的经济类吐丝结茧昆虫,柞蚕微孢子是寄生在柞蚕体内的一种微孢子虫,是柞蚕微粒子病的病原,其主要通过食下传染或者母体传染来感染柞蚕。目前在分子水平上对柞蚕微孢子虫的研究还很少,本研究通过比较分析四种常见的de novo组装软件对柞蚕微孢子虫全基因组的组装,结果显示不同的软件组装的结果相差甚远,由此表明由于柞蚕基因组本身结构的特殊性及组装软件的针对性,导致了组装质量的差异性。本研究对于今后昆虫微孢子虫基因组的组装软件的选择优化提供了重要的参考。

大猿叶虫微孢子虫的初步研究

本文介绍了从哈尔滨市郊区大猿叶虫 Colaphellus bowringeBaly 成虫体内分离出的一种微孢子虫。用光学显微镜和电镜观察其形态和各发育阶段,并对寄主范围及侵染特性等进行了研究。孢子呈长卵圆形,大小5.38±0.45μm×2.65±0.23μm。孢子外壁厚约6.25nm,内壁厚约156nm。极丝管状,外径约108.8nm,绕核13～15圈。长约为孢子长的10～15倍。该孢子虫主要侵染寄主的马氏管、脂肪体、血细胞和气管基质等组织。自然寄生率达61%。实验室条件下尚可感染草地螟和马铃薯瓢虫,并在体内完成各阶段的发育。

感染微孢子虫的棉铃虫幼虫对化学杀虫剂的敏感性

为明确棉铃虫微孢子虫Nosema sp.与杀虫剂混用的效果及其机理,采用感染饲喂和微量点滴法,研究了感染微孢子虫的棉铃虫幼虫对辛硫磷、溴氰菊酯的敏感性变化.健康幼虫与感病幼虫对辛硫磷LC50之比为4.855,对溴氰菊酯LC50之比为7.953.随着微孢子虫感染时间和感染剂量的增加,棉铃虫对杀虫剂的敏感性进一步增强;感染微孢子虫5天,健康幼虫与感病幼虫对辛硫磷的LC50之比为3.278,与感染3天处理相比差异显著;当剂量为107个孢子/mL时,健康幼虫与感病幼虫对辛硫磷的LC50之比为4.090.经微孢子虫处理后,棉铃虫幼虫体内的羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶和乙酰胆碱酯酶的比活力均增高.