过表达pellino-1在Kupffer细胞内毒素耐受时对TRAF3泛素化及MAPK信号通路的调控

【目的】探讨上调pellino-1在Kupffer细胞(KC)内毒素耐受时对肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)泛素化、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路及下游细胞因子分泌情况的影响。【方法】分离、培养C57BL/6小鼠KC,随机分为2组:(1)空载对照组:转染空载质粒48 h后,先给予小剂量LPS(10 ng/mL)刺激24 h,再给予大剂量LPS(300 ng/mL)刺激。(2)过表达组:过表达pellino-1慢病毒转染48 h后,先给予小剂量LPS(10 ng/mL)刺激24 h,再给予大剂量LPS(300 ng/mL)刺激。两组分别于处理后0、5、10、30、60 min收获细胞,蛋白质免疫印迹试验(Western blot)检测pellino-1、K48泛素化(K48ubiquitin,K48-Ub)、TRAF3、JNK、p-JNK、p38、p-p38蛋白水平表达变化;酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α及IL-10的分泌情况。【结果】与空载对照组相比,过表达组pellino-1蛋白表达量在各个时间点均明显升高;K48-Ub水平明显升高;TRAF3蛋白表达量明显降低;JNK、p38蛋白表达量没有明显变化,但p-JNK及p-p38蛋白表达量显著升高;过表达组细胞上清中IL-1β及TNF-α的量明显升高(P<0.05),而IL-10的量则明显降低(P<0.05)。【结论】过表达pellino-1可促进TRAF3蛋白K-48泛素化降解,导致TRAF3蛋白表达量降低,激活下游的MAPK信号,从而抑制内毒素耐受的形成。

过继转移过表达Pellino-1的调节性T细胞对自身免疫性早发性卵巢功能不全小鼠卵巢功能的修复作用

目的探讨过继转移过表达Pellino-1(Peli1)的调节性T细胞(Treg细胞)对自身免疫性早发性卵巢功能不全(POI)小鼠的卵巢功能是否有修复作用,以及对其免疫功能是否具有调控作用。方法采用透明带3多肽(p ZP3)构建自身免疫性POI小鼠模型,将构建的过表达Peli1的慢病毒载体(LV-Peli1)转染至Treg细胞,最后将过表达Peli1的Treg细胞过继转移到模型小鼠体内。将POI模型小鼠随机分为4组(n=5),分别为LV-Peli1-POI组(过继转移过表达Peli1的Treg细胞)、LV-POI组(过继转移转染慢病毒空载体的Treg细胞)、Treg-POI组(过继转移未经任何处理的Treg细胞)、POI模型组(经尾静脉注射等体积PBS)。采用H-E染色观察各组卵巢结构并行各级卵泡计数,免疫组织化学染色检测卵巢组织增殖蛋白Ki-67表达及CD3+T淋巴细胞水平,TUNEL法检测卵巢颗粒细胞凋亡情况,ELISA法检测各组小鼠血清卵巢激素促卵泡激素(FSH)、雌二醇(E2)及细胞免疫因子IL-10、TGF-β的表达水平,考察过表达Peli1对自身免疫性POI的作用。结果与LV-POI组、Treg-POI组及POI模型组相比,LV-Peli1-POI组中始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡的数目均增加,Ki-67表达增高,卵巢颗粒细胞凋亡减少,FSH表达水平下降,E2表达水平升高(P<0.05,P<0.01);LV-Peli1-POI组的CD3+T淋巴细胞的数量减少,IL-10和TGF-β表达水平升高(P<0.05,P<0.01)。结论过继转移过表达Peli1的Treg细胞可有效促进POI小鼠卵巢颗粒细胞增殖、抑制其凋亡,同时改善POI小鼠的卵巢内分泌功能和调节免疫功能,对自身免疫性POI有一定的修复作用。

血浆E3泛素连接酶Pellino-1及降钙素原水平对脓毒症早期诊断的价值

【目的】探讨血浆E3泛素连接酶Pellino-1及降钙素原(PCT)水平对脓毒症早期诊断的价值。【方法】收集我院收治的36例脓毒症患者,其中脓毒症组19例、脓毒性休克组17例,随机纳入同期健康体检者15例作为对照组。通过检测患者血浆Pellino-1蛋白浓度和评估序贯器官衰竭评分(SOFA);分析二者间的关系。【结果】血浆Pellino-1浓度在脓毒性休克组高于脓毒症组及对照组(P<0.05);脓毒症患者血浆中Pellino-1水平与SOFA评分呈正相关性(r=0.890,P<0.05)。Pellino-1受试者工作特征(ROC)曲线下面积为0.813;PCT曲线下面积为0.944。【结论】血浆Pellino-1及PCT水平对脓毒症早期诊断均具有参考价值。早期血浆中Pellino-1升高与不良预后相关。

Pellino 1、锌指蛋白A20、NF-κB P65及IL-6在胎膜早破中的表达及意义

目的探讨胎膜早破(PROM)患者胎膜组织Pellino 1、锌指蛋白A20、核因子-κB(NF-κB)P65及羊水白细胞介素-6(IL-6)的表达及其相关性,为深入了解胎膜早破的发生发展机制提供新途径。方法分别选择30例足月胎膜早破(tPROM)、未足月胎膜早破(pPROM)患者及正常妊娠晚期妇女(对照组),应用免疫组化染色法及Western blot检测胎膜组织Pellino 1、锌指蛋白A20、NF-κB P65表达部位及含量,ELISA法测定羊水中IL-6水平,并分析蛋白表达的相关性。结果 PROM组胎膜组织Pellino 1、NF-κB P65及羊水IL-6表达水平高于对照组(P<0.05),胎膜组织锌指蛋白A20表达低于对照组(P<0.05);pPROM组胎膜组织Pellino 1、NF-κB P65表达及羊水IL-6水平高于tPROM组(P<0.05),pPROM组锌指蛋白A20表达低于tPROM组(P<0.05)。胎膜组织中Pellino 1、NF-κB P65表达与羊水IL-6水平呈正相关(P<0.01),锌指蛋白A20表达与羊水IL-6水平呈负相关(P<0.01)。结论 Pellino 1、NF-κB P65及炎性细胞因子IL-6表达水平升高、锌指蛋白A20表达水平降低在胎膜早破发生中发挥重要作用。

微RNA-21和Peli1在自身免疫性早发性卵巢功能不全小鼠体内的表达及意义

目的探讨miRNA-21和其靶基因Pellino-1(Peli1)在自身免疫性早发性卵巢功能不全(POI)模型小鼠体内的表达和意义。方法将24只雌性BALB/c小鼠随机均分为POI组和对照组(每组12只),分别予皮下注射透明带3(ZP3)多肽和生理盐水。通过卵泡计数、观察发情周期和检测血清雌二醇、卵泡刺激素(FSH)、抗米勒管激素(AMH)水平评估小鼠卵巢功能。采用ELISA测定血清炎症因子γ-干扰素、IL-10水平,流式细胞术分析脾脏调节性T细胞(Treg)比例,生物信息学预测miRNA-21的靶基因,qPCR检测外周血单个核细胞(PBMC)、卵巢组织中miRNA-21表达和PBMC、脾脏Treg中Peli1的mRNA表达。结果二次免疫6周后,POI组小鼠基本无发情期,而对照组小鼠发情周期均正常。POI组小鼠卵巢中各级卵泡的数量,血清雌二醇、AMH、IL-10水平,脾脏Treg比例,以及PBMC、卵巢组织中miRNA-21表达均低于对照组(P均<0.05),而血清FSH、γ-干扰素水平均高于对照组(P均<0.01)。生物信息学预测显示Peli1为miRNA-21的靶基因。POI组小鼠PBMC、脾脏Treg中Peli1的mRNA表达均低于对照组(P均<0.05)。结论miRNA-21和其靶基因Peli1在自身免疫性POI模型小鼠中的表达均降低,提示miRNA-21和Peli1可能参与自身免疫性POI的发病。

Pellino1 SUMO修饰位点突变对TRAF6介导的NF-κB信号转导的影响

目的:研究Pellino1蛋白翻译后修饰——小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)修饰对肿瘤坏死因子受体相关分子-6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)介导的核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)信号转导的影响。方法:构建Pellino1 SUMO修饰位点突变的质粒,与TRAF6、泛素(ubiquitin,Ub)质粒共转染至HEK-293细胞中,荧光显微镜观察转染效率,免疫共沉淀的方法检测突变型Pellino1与TRAF6的相互结合作用;同时,检测Pellino1和TRAF6的泛素化修饰水平。采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导炎症反应,分提胞浆胞核蛋白,Western blot检测核因子κB的抑制蛋白α(inhibitor of NF-κBα,IκBα)的磷酸化和NF-κB P65的核转位,分析Pellino1蛋白SUMO修饰突变对TRAF6介导的NF-κB信号通路的影响。结果:与野生型Pellino1相比,SUMO修饰突变型Pellino1不仅增加Pellino1的自身泛素化修饰水平,而且可增加其与TRAF6的相互结合作用,并增强TRAF6的泛素化修饰;LPS刺激可增加IκBα的磷酸化和NF-κB P65的核转位,转染使Pellino1SUMO修饰突变高表达可明显增强LPS诱导的NF-κB信号激活。结论:Pellino1 SUMO修饰突变,可通过增加Pellino1的自身泛素化修饰及其与TRAF6的结合,增强TRAF6的泛素化,最终促进TRAF6介导的NF-κB信号通路的激活。