头孢曲松低敏淋球菌中penA基因的初步研究

目的:检测头孢曲松低敏淋球菌中penA基因的改变,探讨其是否与淋球菌对头孢曲松敏感性降低有关。方法:通过对5株头孢曲松低敏和1株头孢曲松敏感的淋球菌进行penA基因全基因测序,进一步了解penA基因的碱基置换或插入情况及青霉素结合蛋白2(PBP2)的结构模式。结果:5株头孢曲松低敏淋球菌的penA基因中有多个碱基置换或突变,没有发现含有镶嵌状penA基因结构模式。结论:penA基因的多个碱基置换或突变可能与淋球菌对头孢曲松敏感性降低相关。

新penA镶嵌等位基因致淋病奈瑟菌头孢菌素耐药的分子机制

目的:追踪湖南首例头孢菌素耐药淋病奈瑟菌株wls18099分子流行病学信息,并探讨耐药机制。方法:采用NG-MAST对wls18099菌株分型。应用PCR扩增penA、mtrR、penB和ponA这4种与头孢菌素耐药密切相关的基因。将PCR产物测序得到的碱基数据与野生型菌株M32091比对,筛选出可疑耐药突变位点。用筛选的wls18099菌株耐药基因penA的PCR产物转化标准菌株WHO M、WHO L和临床分离的头孢菌素敏感菌株wls11020,验证其耐药性。结果:wls18099属于ST14155,其基因组含一种新的penAwlsⅩⅩⅩⅣ/K503P镶嵌等位基因。三种菌株转化该等位基因后均产生头孢曲松与头孢克肟耐药现象,MIC值上升4~62倍。结论:这种新的penA wlsⅩⅩⅩⅣ/K503P镶嵌等位基因可能导致wls18099菌株对头孢克肟和头孢曲松耐药。湖南及周边省份应加强对其监控,以防播散。

penA和mtrR基因突变在体外诱导淋球菌对头孢曲松耐药作用的研究

目的探讨penA、mtrR基因突变在淋球菌对头孢曲松耐药中的作用。方法分别选取淋球菌标准菌株（ATCC-49226）、临床头孢曲松敏感菌株（2012．4052、2012．15361）及低敏菌株（2012．5616），体外次抑菌浓度诱导对头孢曲松耐药，提取诱导前原代菌株及诱导后子代耐药菌株的DNA，对penA和mtrR基因进行扩增与测序。结果菌株2012—5616和ATCC．49226分别在诱导至第26和28代时获得最低抑菌浓度（MIC）≥1mg／L的耐药菌株，菌株2012—4052和2012．15361分别在诱导至第22和36代时获得MIC≥0．5mg／L的耐药菌株。penA基因测序结果显示，ATCC-49226菌株诱导后出现A501T和G542S突变位点，另3株菌诱导前后penA基因均未出现新的突变位点；4株突变菌株的青霉素结合蛋白2（PBP2）基因序列型都为XⅧ，未检测到penA镶嵌状结构模式。mtrR基因测序结果显示，2012—5616和ATCC-49226菌株在诱导前后均发生A39T突变，2012-4052菌株诱导后在mtrR编码区发生A39T突变。结论penA基因中的A501T和G542S突变与mtrR基因发生的A39T突变可能在头孢曲松耐药中发挥作用。

不同实验条件对淋病奈瑟球菌体外转化效率的影响

目的探讨不同实验条件对淋病奈瑟球菌(淋球菌)体外转化效率的影响。方法以淋球菌D株DNA为模板扩增penA基因,采用重叠延伸PCR制备penAA501V(耐药突变)基因,购买淋球菌penAH041基因(耐药阳性对照)。制备含penA/penAA501V/penAH041基因的质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,采用蓝白筛选培养基克隆扩增;分别采用日本TaKaRa公司质粒提取试剂盒和天根生化科技(北京)有限公司高纯度质粒小提试剂盒提取质粒。以penA质粒、penAA501V质粒、penAH041质粒、penAA501V基因、penAH041基因为底物采用直接孵育法转化淋球菌受体菌株A43、A49,测定转化率(CFU/μg)及头孢曲松(CRO)的最小抑菌浓度(MIC)。以penAA501V、penAH041基因为底物,采用脂质体法转化受体菌株A43、A49,观察转化效率及头孢曲松的MIC。结果以D株淋球菌DNA为模板,成功获得1749 bp的penA及penAA501V基因。提取质粒并电泳后,TaKaRa试剂盒提取的含淋球菌penA、penAA501V、penAH041基因的质粒主要集中在2500 bp处,迁移速度较快;天根试剂盒提取的质粒主要集中在5000 bp处,迁移速度较慢。直接孵育法转化时,含野生型penA的A43株的MIC为0.001μg/ml,转入penA质粒后MIC上升至0.002μg/ml,转入penAA501V质粒和penAA501V基因转化株MIC均为0.004μg/ml,转入阳性对照penAH041质粒和penAH041基因后MIC均升至0.512μg/ml;各底物孵育后CRO对A49株的MIC值与空白对照相同,均为0.016μg/ml。脂质体法转化时,含野生型penA的A43株对CRO的MIC是0.002μg/ml,A49株MIC为0.016μg/ml;penAA501V基因转化A43株后MIC升至0.004μg/ml,转化A49株后仍为0.016μg/ml;阳性对照penAH041基因转化A43和A49株后MIC均升至0.250μg/ml,较空白对照分别升高至125倍和15.6倍。结论选择质粒为底物采用直接孵育法对A43株淋球菌有较好转化效率,不同质粒提取方法可能影响转化效率,对于直接孵育法转化效率不高的A49株可采用脂质体法。