黑曲霉pepB基因缺失菌株的构建及其功能分析

以黑曲霉 (Aspergillusniger)GICC2 773基因组DNA为模板 ,用PCR方法分别扩增pepB基因中的上游约 1 4kb和下游约 1 3kb两段DNA序列 ,将此两段序列按同一方向分别插入质粒pMW1中潮霉素抗性基因 (hph)表达单元的 5′和 3′端 ,构建成重组质粒pMW1 pepB ,用于通过同源重组靶向破坏基因组中的pepB基因。同源重组则采用原生质体 PEG方法 ,将酶切pMW1 pepB得到的线性片段转化A .nigerGICC2 773菌株 ,通过潮霉素选择平板得到 6 2个Hgy抗性转化子 ,然后采用PCR方法从这些抗性转化子中筛选到 1个由于同源重组产生的pepB基因缺失突变菌株pepB2 9。功能分析显示该突变株的酸性蛋白酶活性有明显下降 。