小分子肽CSNRDARRC与膀胱移行细胞癌组织特异性结合的研究

目的明确小分子肽CSNRDARRC与膀胱移行细胞癌组织结合的特异性及其结合位点。方法选用膀胱移行细胞癌、肾癌、胃癌及腺性膀胱炎石蜡组织块,分别为107、43、68、16例;进行连续切片、烤片、脱蜡、抗原修复,封闭,再采用免疫荧光技术加FITC-六氨基己酸-CSNRDARRC复合物,荧光显微镜定性分析,单纯加FITC作为阴性对照。采用SPSS13.0软件进行统计分析,P<0.05为有显著性统计学差异。结果单纯FITC标记的各蜡块组织(阴性对照组)均未见有高亮荧光点,FITC-六氨基己酸-CSNRDARRC复合物标记的膀胱移行细胞癌组织有99例出现高亮荧光点,特异性为92.52%(99/107),而在肾癌、胃癌及腺性膀胱炎组织分别有6例、5例、2例有荧光亮点,特异性分别为9.52%(5/43),8.82%(6/68),12.50%(2/16),通过DAPI着色确定高亮荧光点主要定位于细胞核。CSNRDARRC与膀胱移行细胞癌组织的结合较其与肾癌、胃癌及腺性膀胱炎组织的结合有显著差异(P<0.05),而CSNRDARRC与肾癌、胃癌及腺性膀胱炎组织间结合比较无统计学意义(P>0.05)。结论小分子肽CSNRDARRC与膀胱移行细胞癌特异性结合率显著高于其他肿瘤组织,但对其他组织仍有标记,且结合位点在细胞核内,这为该肽段对膀胱移行细胞癌临床诊断提供理论基础;为膀胱癌的治疗奠定一定的理论依据。

肺癌细胞特异性结合肽的体内筛选及初步鉴定

目的筛选能与肺癌细胞特异性结合的多肽并初步鉴定其亲和力和特异性。方法用人肺癌细胞A549使裸鼠致瘤,尾静脉注射肽库。取荷瘤鼠的肿瘤组织,用体内噬菌体展示技术进行筛选;经过3轮体内筛选,获得在肿瘤组织中富集的噬菌体;利用ELISA和细胞免疫化学DAB染色法初步鉴定各克隆亲和力、特异性;对阳性克隆行DNA测序,利用生物信息学对此多肽进行分析、比对。结果随机挑选的10个单克隆中,8个均对A549细胞具有较高亲和力,其中3号克隆亲和力最高,其可特异性结合肺癌细胞A549和NCI-H1299,且对A549的亲和力强于NCI-H1299。DNA测序结果显示该序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank DNA序列数据库和Swiss-Prot蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性。结论筛选出了能与肺癌细胞特异性结合的多肽。

骨肿瘤细胞特异性结合肽修饰固体脂质纳米粒的肿瘤靶向性研究

目的制备骨肿瘤细胞特异性结合肽—SLT肽修饰的固体脂质纳米粒(SLT peptide modified solid lipid nanoparticles,SLT-SLNs),研究其与人骨肉瘤MG63细胞的亲和力和肿瘤靶向性。方法细胞摄取实验研究肿瘤细胞对SLT-SLNs的摄取。构建骨肿瘤裸鼠异位模型,研究不同固体脂质纳米粒的体内靶向性。结果 SLT-SLNs的平均粒径为(115.7±8.7)nm,多分散性系数为0.12,Zeta电位为(13±2.25)mV。细胞摄取实验结果显示MG63细胞对SLT-SLNs的摄取效率是SLNs的4.4倍(P<0.01);体内活体成像实验结果显示SLT-SLNs组荷瘤裸鼠肿瘤组织的荧光强度明显强于SLNs组。结论 SLT肽修饰的固体脂质纳米粒具有良好的骨肉瘤细胞亲和力,是一种潜在的高效骨肿瘤靶向给药系统。

内毒素休克小鼠肝脏血管内皮细胞特异性结合肽的体内筛选及初步鉴定

目的:利用体内噬菌体展示技术筛选能与内毒素休克小鼠肝脏血管特异性结合的短肽。方法:尾静脉注射噬菌体环七肽库至内毒素休克小鼠体内,循环10min后,回收肝脏中的噬菌体。将回收的噬菌体扩增、纯化,并以此为起始物进行下一轮筛选。经过4轮筛选后,将所得文库与正常小鼠做一次差减筛选。随机挑取噬菌体单克隆进行测序,序列分析后,进行噬菌体的体内回输实验及免疫组化分析,验证所筛得噬菌体克隆的导向情况。结果:经过4轮体内筛选,肝脏中噬菌体回收率逐步提高,证明噬菌体文库在肝脏血管中得到有效富集。DNA测序后发现,10条序列中有5条为LTTWAPA,体内回输实验和免疫组化实验均证实表达该序列的噬菌体能有效地靶向于休克小鼠肝脏血管内皮细胞。结论:筛选到的短肽LTTWAPA能特异性结合于内毒素休克小鼠肝脏血管内皮细胞,有可能对内毒素休克的治疗具有重要意义。

人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞特异性结合肽的筛选及鉴定

背景与目的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常见的肺癌组织学类型,也是病死率最高的恶性肿瘤之一。多肽作为光学分子成像探针的主体可以实现肿瘤的早期筛查及诊断,提高患者存活率。本研究旨在利用体内噬菌体展示技术筛选与人NSCLC细胞NCI-H1299高度结合的小分子多肽并通过体外实验鉴定其结合特异性。方法制备NCI-H1299细胞荷瘤裸鼠模型,用噬菌体展示环七肽库进行3轮体内筛选后随机挑取噬菌体克隆,免疫组织化学法及酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)鉴定噬菌体克隆对NCI-H1299细胞的亲和力。提取阳性单克隆噬菌体DNA测序获得外源多肽氨基酸序列,将重复率最高的序列化学合成多肽并进行异硫氰酸荧光素(fluorescein,FITC)标记,制备光学分子探针,初步鉴定其对NCI-H1299细胞的特异性。结果经3轮体内筛选后噬菌体富集率是首轮的341.3倍;免疫组织化学染色显示随着筛选次数增加,肿瘤组织中结合的噬菌体不断增加,且结合量明显高于正常组织;ELISA结果显示随机挑取的30个噬菌体克隆中20个为阳性克隆,经测序后将重复率最高的序列合成多肽并命名为NSP1;四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium assay,MTT)、细胞划痕实验表明NSP1不会影响细胞增殖、迁移;流式细胞术、细胞免疫荧光结果表明NSP1可与NCI-H1299细胞特异性结合。结论利用体内噬菌体展示技术成功得到了与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽NSP1,为NSCLC的早期诊断及靶向治疗奠定了研究基础。

靶向结合骨肉瘤血管内皮细胞短肽的体外功能验证

目的验证体外培养的鼠源性骨肉瘤血管内皮细胞(osteosarcoma-associated vascular endothelial cells,OAVECs)与7肽TKPDKGY(TY-7)的结合特异性。方法原代培养获得OAVECs和裸鼠主动脉血管内皮细胞(aortic endothelial cells,AECs)并进行内皮细胞免疫组化鉴定。合成TY-7并在其N端标记一个荧光素(FITC),通过荧光显微镜和流式细胞仪来评价TY-7与OAVECs、AECs及骨肉瘤细胞UMR-106的亲和度。结果荧光显微镜可见OAVECs与TY-7结合后在镜下清晰显像,而UMR-106细胞和AECs并不显像。流式细胞仪则定量显示TY-7与靶细胞OAVECs的结合率(89.54%)远高于UMR-106(0.27%)和AECs(0.22%)。结论TY-7可高度特异结合OAVECs,而不与AECs及骨肉瘤细胞UMR-106结合。