hPeriod1_(PAS)结构域相互作用蛋白的筛选和研究

目的寻找与近日节律系统核心基因Period1(Per1)相互作用的新蛋白,揭示近日节律相关的可能信号通路。方法采用酵母双杂交方法,以人Per1的PAS结构域为诱饵,扫描人下丘脑cDNA文库,并通过体外转录、免疫共沉淀验证蛋白间相互作用;通过RT-PCR检测RACK1(receptors for activated C-k inase)表达的组织特异性及节律性;运用RNA i技术初步研究RACK1与Per1的信号联系。结果人下丘脑区域RACK1蛋白与Per1存在相互作用;RACK1在多器官组织保守表达,但其表达未呈现明显节律性;上调及下调Per1表达,RACK1的RNA水平无显著变化。结论细胞内接头分子RACK1是一种新的Per1作用蛋白,可能介导、调控Per1的功能。

层粘连蛋白受体Ⅰ与hPeriod1相互作用的研究

目的寻找与节律蛋白hPeriod1(hPer1)相互作用的蛋白,并对筛选出的层粘连蛋白受体Ⅰ(Lamr1)在节律系统中的功能作初步研究。方法分别构建pGAD rec脑/cDNA文库和pGBKT7/hPer1bH LH-PAS重组诱饵蛋白质粒,酵母双杂交筛选下丘脑里与hPer1相互作用的蛋白。利用RT-PCR技术检测新蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织中的表达及在SH-SY5Y细胞中的节律性质。通过RNA干扰技术研究新蛋白与hPer1的关系。结果通过酵母双杂交筛选,证明Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用。该蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织广泛表达,灰度比较显示经马血清诱导后的SH-SY5Y细胞的hPer1表达呈现近日节律,而Lamr1表达无节律变化。RNA干扰显示hPer1表达下调不影响Lamr1的表达。结论Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用,但其表达在RNA水平无节律变化。Lamr1参与细胞的黏附、转移和侵袭。其前体蛋白作为核蛋白参与细胞蛋白的合成。Lamr1可能参与hPer1相关的生物节律系统的信号传出。

PMA诱导C6细胞rPer1,rDbp基因的近日节律表达

目的寻找一种新的体外节律诱导剂以研究C6神经胶质瘤细胞近日节律基因的表达情况。方法采用PMA(phorbol12-myristate13-acetate),100nmol/L)及50%的马血清刺激体外培养的小鼠NIH-3T3细胞,RT-PCR检测不同时间点mPer1mRNA的表达水平,比较两者的诱导效率;PMA刺激体外培养的大鼠C6神经胶质瘤细胞,RT-PCR检测不同时间点rPer1,rDbpmRNA的表达水平。结果PMA及50%的马血清均能诱导NIH-3T3细胞mPer1的近日节律表达且诱导效率近似;并首次发现C6细胞的rPer1,rDbp基因存在着近日节律振荡。结论PMA是一种有效的体外节律诱导剂;经PMA诱导后,C6细胞的节律基因存在近日振荡,为体外研究授时因子对近日节律的导引机制提供依据。

肝细胞癌Period1表达与预后的关系

目的:探讨Period1在肝细胞癌(HCC)组织中的表达及意义。方法:用RT-PCR与Western blot法检测30例HCC组织与其癌旁肝组织及5例正常肝组织中Period1 mRNA与蛋白表达;甲基化特异性PCR检测HCC组织与癌旁肝组织中Period1启动子甲基化水平;免疫组化检测67例HCC组织及其癌旁肝组织石蜡切片中Period1蛋白的表达;分析Period1的表达与HCC患者临床病理特征及预后的关系。结果:HCC组织Period1 mRNA和蛋白的表达水平均较癌旁肝组织与正常肝组织明显降低(均P<0.05),而两者在癌旁肝组织与正常肝组织间差异无统计学意义(均P>0.05);HCC组织Period1启动子甲基化水平较其癌旁肝组织明显增高(均P<0.05)。HCC组织石蜡切片中Period1阳性表达率为47.8%,而癌旁肝组织阳性表达率为83.6%,差异有统计学意义(P<0.05);Period1表达与HCC分化程度、结节数目、有无静脉浸润有关(均P<0.05);Period1阳性表达HCC患者中位复时间与中位生存时间均明显短于阳性者(均P<0.05)。结论:Period1在肝癌中表达下调可能与HCC的发生发展和侵袭转移密切相关;启动子甲基化可能是Period1表达下调的重要机制。