牵张刺激下牙周膜细胞外泌体miR-181d-5p在调控成骨细胞分化中的作用

目的探索牵张加载下牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)外泌体对成骨细胞分化的影响,以及牵张加载下PDLCs外泌体在力相关牙周组织改建中的调控作用。方法对体外培养人PDLCs施加20%牵张应变后,提取上清中的外泌体与成骨细胞共培养,检测成骨细胞分化情况,并探索外泌体中发挥调控作用的miRNA。结果牵张加载下PDLCs分泌的外泌体可上调成骨细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、转录因子Osterix(Osx)、I型胶原蛋白(type I collagen,COL-1)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP 2)等成骨相关因子表达,促进细胞成骨向分化。牵张加载下PDLCs外泌体差异表达miRNA中,miRNA-181d-5p表达量上调达107倍,将其转染成骨细胞后,成骨细胞中ALP、Osx、Col-1、Runx2、Ocn和BMP2等成骨相关因子表达亦增加。结论本研究初步揭示了牵张加载下PDLCs外泌体miR-181d-5p在调控成骨细胞分化中的作用,对于明确力相关牙周组织改建中的信号通路具有重要科学意义。

应用细胞-支架构建方式的组织工程方法促进牙周组织再生的实验研究

目的:观察评价细胞 -支架构建方式的组织工程方法对牙周组织再生修复的影响和意义,探讨自体牙周膜细胞(PDLCs)和纳米羟基磷灰石材料 -纳米羟晶 -胶原仿生骨材料 (nHAC)分别用作牙周组织工程种子细胞和支架材料的可行性。方法:改良组织块法体外培养动物自体PDLCs,传代扩增后接种到nHAC三维支架上,再植入动物人工牙周组织缺损,表面覆盖聚四氟乙烯 (e-PTFE)膜,以单纯翻瓣组和单纯GTR组作为对照。术后 8周进行组织学观察和测量,分析评价其牙周组织的再生情况。结果:自体PDLCs-nHAC-膜复合植入组较单纯翻瓣组和单纯GTR组有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨质生成,且未见上皮长入。结论:应用细胞-支架构建方式的牙周组织工程方法能更有效地促进牙周组织再生和重建,而自体PDLCs可作为牙周组织工程的种子细胞,nHAC可作为牙周组织工程的支架材料。

内毒素对人牙周膜细胞Toll样受体2和Toll样受体4表达的影响

目的:观察内毒素(LPS)刺激后人牙周膜细胞Toll样受体2和Toll样受体4的表达,探讨牙周膜细胞作为免疫活性细胞在牙周炎局部免疫反应中的作用。方法:组织块法原代培养人牙周膜细胞,经来源鉴定后,取生长良好的第4代细胞用LPS进行刺激,分别于刺激0、4、8、12、24 h,运用免疫细胞化学染色法检测TLR2和TLR4在牙周膜细胞中的表达;利用多功能真彩色细胞分析管理系统进行图像分析,对TLR2和TLR4进行免疫组化评分(IHS)。结果:无LPS刺激的对照组(刺激O h)TLR2和TLR4的表达均为弱阳性,加入LPS后,染色增强,且随着刺激时间的延长而增加(P<0.05),LPS刺激后各时间点TLP2和TLR4的IHS分值与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:内毒素的刺激可以使牙周膜细胞TLR2和TLR4表达增多,提示牙周膜细胞参与牙周局部免疫反应。

ERK信号通路参与调控周期性张应变诱导的人牙周膜细胞增殖

目的探讨周期性张应变对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)增殖的影响及其相关机制。方法应用FX-4000T细胞应变加载系统,对体外培养的hPDLCs施加周期性张应变,幅度分别为10%和20%,加载时间为6h和24h,频率均为0.1Hz,以未加载的静态细胞作为对照组。应用流式细胞术检测人牙周膜细胞细胞周期的变化,并应用Western blot法检测细胞增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞内信号转导分子p-ERK1/2表达的变化。用ERK1/2的特异性抑制剂PD98059预处理细胞后,在0.1Hz,10%幅度条件下,加载6h,检测p-ERK1/2的表达水平变化对细胞PCNA表达的影响。结果与静态组相比,周期性张应变增加了S期人牙周膜细胞的比例,并诱导人牙周膜细胞的PCNA和p-ERK1/2表达增加,10%幅度和20%幅度相比无显著性差异。同一幅度张应变,加载6h和24h对细胞PCNA和p-ERK1/2表达的影响无显著性差异。ERK1/2的抑制剂PD98059不仅可以明显抑制张应变诱导的p-ERK1/2活化,而且张应变诱导的细胞PCNA表达也被明显抑制。结论周期性张应变可激活ERK信号通路,促进体外培养人牙周膜细胞的增殖。

人牙周韧带细胞在聚羟基乙酸支架上体外三维培养的实验研究

目的 :应用聚羟基乙酸 (polyglycolicacid ,PGA)作为人牙周韧带细胞 (periodontalligamentcell,PDLC)的三维体外培养支架 ,观察细胞的形态学特征和生物学性状。方法 :将人牙周韧带细胞与PGA三维支架进行体外复合培养 ,用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞形态结构及其与支架的粘附性和组织相容性 ,并用Ⅰ型胶原抗体检测细胞的Ⅰ型胶原分泌情况。结果 :光镜和扫描电镜显示 ,人PDLC在PGA三维支架上粘附良好 ,分泌基质旺盛。免疫组化染色显示细胞支架复合物中Ⅰ型胶原表达阳性。结论 :人PDLC在PGA三维支架上能够维持其形态学特征及生物学性状。聚羟基乙酸具有良好的粘附性和生物相容性 。

组织工程用于修复慢性牙周组织缺损的动物实验研究

目的:应用细胞型和/或非细胞型组织工程化牙周组织移植修复慢性牙周缺损的动物实验,探讨其用于牙周再生治疗的可行性。方法:人工构建5只成年杂种狗慢性牙周缺损病变模型,分别随机采用:引导组织再生治疗术+富血小板血浆+B ioOss(GTR+PRP+B ioOss)、引导组织再生治疗术+富血小板血浆+B ioOss+自体牙周膜细胞(GTR+PRP+B ioOss+PDLCs)、引导组织再生治疗术+自体牙周膜细胞(GTR+PDLCs)和GTR治疗,其中GTR组6颗牙,其余3组各为8颗牙。12周后作病理切片,HE染色观察牙周组织再生情况。结果:动物实验发现GTR组的新生牙槽骨、牙骨质和牙周组织高度分别为(0.52±0.21)mm、(0.8±0.13)mm、(1.9±0.10)mm。而另外3组的新生牙槽骨、牙骨质和牙周组织高度分别为GTR+PRP+B ioOss组:(1.36±0.17)mm、(1.92±0.18)mm、(2.62±0.16)mm;GTR+PRP+B ioOss+PDLCs组:(1.42±0.22)mm、(2.07±0.19)mm、(2.68±0.20)mm;GTR+PDLCs组:(1.39±0.19)mm、(1.82±0.16)mm、(2.55±0.12)mm,这3组牙槽骨、牙骨质和牙周组织的修复再生效果均明显优于GTR组(P<0.05),而它们之间的差别无显著性。结论:应用GTR技术结合组织工程可显著促进狗牙周组织缺损的再生。

釉基质蛋白对人牙周膜细胞内源性TGF β_1分泌的影响

目的 :探讨釉基质蛋白 (EMPs)剂量变化和作用时间变化对人牙周膜细胞 (PDLC)内源性转化生长因子 β1(TGFβ1)分泌的影响。方法 :采用组织块法培养人牙周膜细胞 ,酶联免疫测定 (ELISA)法测定EMPs对PDLC分泌TGFβ1的浓度效应和时间效应。结果 :EMPs作用后 ,实验组PDLC分泌TGFβ1明显高于对照组 ,且有浓度依赖性。EMPs作用的前 4d ,PDLC分泌TGFβ1的能力增长很快。结论 :EMPs能有效促进PDLC分泌TGFβ1。

人牙周膜细胞及炎症龈组织中mCD14表达的免疫组化研究

目的 研究人PDLC及炎症龈组织中mCD14表达情况。方法 采用免疫组化SABC方法。结果 正常人牙周膜细胞mCD14染色为阳性反应 ,但细胞经脂多糖刺激 2天后 ,胞浆染色要比未刺激的细胞染色深。健康牙龈组织中mCD14表达阴性 ;边缘性龈炎和牙周炎龈组织上皮棘层细胞mCD14呈强阳性表达 ,增生性龈炎也呈阳性表达。结论 mCD14可在非髓样细胞中表达 ;

牙周组织OPG-RANKL表达调控研究的新进展

牙周炎是一类以牙槽骨吸收为主要特征的感染性疾病,但其病因理论中的许多具体机制尚未明了。有研究报道牙周韧带细胞能检测出OPG-RANKL表达。由于OPG-RANKL能影响局部骨组织代谢微环境,因此,它是调节破骨细胞活化和成熟的关键因子。近年来的研究表明:这一对因子在人牙周韧带细胞表达受多种因素的调节。本文主要就这方面的研究做一综述。

松质骨基质作为细胞载体应用于牙周组织工程的实验研究

目的研究评价松质骨基质(CBM)作为细胞载体应用于牙周组织工程的可行性及意义。方法将体外培养的犬自体牙周膜细胞(PDLCs)接种到CBM三维支架上,扫描电镜观察PDLCs在CBM支架上的生长、附着情况;同时,将PDLCs/CBM复合植入动物牙周组织缺损,以空白组及仅植入CBM组为对照组,术后8周观察评价其牙周组织的再生情况。结果扫描电镜显示PDLCs在CBM上伸展充分,生长旺盛,而CBM具有良好的多孔网状结构。动物实验结果可见PDLCs/CBM复合植入组较对照组有更多的新生牙骨质、新生牙周膜和新生牙槽骨生成,缺损处牙周组织几近完全再生,且未见上皮长入。结论 CBM可作为细胞载体用于牙周组织工程研究,有望用作牙周组织工程的支架材料。

不同浓度血清对人牙周膜细胞生长特性的影响

目的探讨人牙周膜细胞在不同浓度血清培养液中的生长特性。方法用倒置显微镜和MTT法观察人牙周膜细胞在10%、5%、2%浓度血清培养液中的生长和增殖变化,使用流式细胞仪检测不同血清浓度对细胞周期的影响。结果人牙周膜细胞在2%血清培养液中增殖速率与增殖指数均最低,在10%血清培养液中最高,3组细胞的增殖速率具有显著性的统计学差异。结论体外培养人牙周膜细胞的增殖具有血清浓度依赖性,高血清浓度培养液的促增殖效应强。

中间普氏菌内毒素刺激人牙周膜细胞上调表达基因的研究

目的 :用基因芯片研究中间普氏菌内毒素刺激前后 ,牙周膜细胞上调表达基因。方法 :应用点样数 5 12点的基因芯片分析中间普氏菌内毒素刺激人牙周膜细胞上调表达基因。结果 :研究发现中间普氏菌内毒素刺激牙周膜细胞后有 6条上调基因 ,其中部分基因与蛋白激酶和蛋白磷酸酶有关。结论 :牙周致病菌内毒素刺激牙周膜细胞后 ,可引起部分基因表达上调 ,从而影响牙周膜细胞正常的生理功能。

黄芩苷对人牙周膜细胞RANKL-OPG表达的影响及其作用机制

目的研究黄芩苷对人牙周膜细胞核因子-κB受体激活物配基和骨保护素(RANKL-OPG)表达的影响及其作用机制。方法首先构建转化生长因子βⅡ型受体(TGF-βⅡR)靶向siRNA真核表达载体,转染正常人外周血T细胞,使T细胞表面的TGF-βⅡR基因沉默,继而将转染与未转染靶向性TGF-βⅡR基因沉默的T细胞和正常人牙周膜成纤维细胞置于加有黄芩苷和内毒素的培养基中,分为6组:①正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞+黄芩苷;②正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞;③正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞+黄芩苷;④正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞;⑤正常牙周膜成纤维细胞+黄芩苷;⑥正常牙周膜成纤维细胞。共培养48h,RT-PCR检测牙周膜细胞RANKL和OPG的表达,计算RANKL/OPG比值。结果①酶切鉴定正确的克隆测序结果与设计的目的序列完全一致;②转染siRNA1的T细胞组的TGF-βⅡRmRNA的表达被明显抑制;③RANKL/OPG的比值在各组间的差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建了TGF-βⅡR靶向siRNA真核表达载体并成功转染T细胞;黄芩苷可以降低牙周膜细胞表面RANKL/OPG比值;TGF-β的信号传导在黄芩苷影响牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG表达过程中起着重要作用;黄芩苷并非只通过TGF-β信号传导通路,而是亦通过其他通路对牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG进行调控。

FGF2基因转染对人牙周膜细胞生物学性状的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(FibroblastGrowthFactor2,FGF2)基因转染对人牙周膜细胞(Periodontalligamentcells,PDLCs)生物学性状的影响。方法:将FGF2基因转入PDLCs,通过免疫组化SABC及免疫印记法检测其稳定表达,并检测转基因细胞增殖活力及碱性磷酸酶合成情况。结果:免疫细胞化学证实转染与未转染细胞均在胞浆内表达FGF2,但转染FGF2细胞较未转染组染色深,免疫印迹杂交结果显示转染前后均表达17KDFGF2,但转染后表达量增高。FGF2基因转染可增强细胞增殖能力,但碱性磷酸酶活性未见明显变化(P>0.05)。结论:FGF2基因能被转入PDLCs并得到稳定表达,转基因细胞增殖与合成明显增强,但转染FGF2基因不能促进细胞分化。

不同牙龈卟啉单胞菌菌株对人牙周膜细胞MMP-3和MMP-9表达的影响

【目的】比较3种牙龈卟啉单胞菌菌株P.gingivalis W83、P.gingivalis ATCC33277、P.gingivalis FDC381刺激人牙周膜细胞表达基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)MMP-3、MMP-9水平的差异。【方法】厌氧培养细菌P.gingivalis W83、P.gingivalis ATCC33277和P.gingivalis FDC381,原代培养人牙周膜细胞,3种菌株分别与人牙周膜细胞混合培养5 min、30 min、60 min、120 min、24 h、48 h,采用ELISA法测定上清液中MMP-3和MMP-9的浓度。【结果】在各时间点,受细菌刺激的人牙周膜细胞表达MMP-3和MMP-9的浓度均高于未受细菌刺激组(P<0.01)。P.gingivalis W83刺激人牙周膜细胞表达的MMP-3、MMP-9浓度明显高于P.gingivalis ATCC33277和P.gingivalis FDC381,经方差分析,差异具有显著性(P<0.01)。【结论】高毒力株P.gingivalis W83可以通过细菌-细胞间相互作用导致局部牙周组织中MMP-3、MMP-9高表达,造成牙周组织破坏。

TNF-α刺激人牙周膜细胞表达MMP-9的研究

目的研究TNF-α对人牙周膜细胞(hPDLCs)表达MMP-9的影响。方法分别以1、2、5 ng/mL浓度的TNF-α刺激hPDLCs 24 h,以及2 ng/mL浓度的TNF-α刺激hPDLCs 6 h、12 h、24 h、48 h,应用ELISA法测定细胞上清液中MMP-9的表达水平。结果随着TNF-α浓度增大和作用时间延长,hPDLCs表达MMP-9均增加。结论 TNF-α能够以时间和剂量依赖的方式增强hPDLCs表达MMP-9。

人牙周膜细胞复合壳聚糖-胶原温敏水凝胶异种移植构建可注射骨组织的研究

目的观察人牙周膜细胞复合壳聚糖-胶原温敏水凝胶异种移植小鼠皮下的组织再生,评价其作为可注射骨组织的可行性。方法将壳聚糖、胶原、β-磷酸甘油钠按比例混合构建温敏性水凝胶。通过活/死细胞染色法检测人牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)在壳聚糖-胶原水凝胶三维培养中的存活。PDLCs成骨预诱导后复合水凝胶注入小鼠背部皮下,6周后取出植入物,通过HE、Masson染色法观察组织的再生以及胶原纤维的形成。结果壳聚糖-胶原水凝胶可支持PDLCs的三维培养,体内实验表明无刺激性。复合细胞后的凝胶支架在动物皮下可形成血管化包块,结缔组织和胶原纤维形成明显高于无细胞的对照组。结论壳聚糖-胶原温敏水凝胶是一种理想的可注射支架,复合PDLCs有望构建可注射骨组织,修复骨缺损。

矿化液对人牙周膜细胞增殖和功能的影响

目的比较人牙周膜细胞在矿化条件与非矿化条件下增殖和分化的过程,评价矿化液对其功能的影响。方法人牙周膜细胞原代培养,鉴定。将增殖稳定的细胞分别在矿化条件和非矿化条件下培养,检测其形态、碱性磷酸酶活性、细胞周期等。结果人牙周膜细胞增殖基本稳定后矿化组与非矿化组细胞分裂增殖指数相似,但前者碱性磷酸酶活性明显较高且持久,表现出较强的钙化能力。结论人牙周膜细胞增殖基本稳定后加入矿化液对细胞增殖无影响但可明显促进细胞矿化功能,说明人牙周膜细胞在矿化条件下可以表现其成骨特性。

流式细胞技术分析骨形成蛋白对人牙周膜细胞增殖和分化的影响

目的 :检测牛骨形成蛋白 (b BMP)对离体培养的人牙周膜细胞 (PDL C)的 DNA合成和细胞周期的影响情况。方法 :培养的第 7代 PDL C分成对照组和 BMP作用实验组 ,以含 1% FBS的 DMEM培养 72 h;消化下细胞 ,固定 ,调整细胞数在 1× 10 6/m l,加入复合 DNA荧光检测试剂后 4℃染色 3 0 m in,用流式细胞仪 (FCM)测试 ,联机专用软件分析处理。结果 :实验组 PDL C的 DNA合成量 (S% )显著高于对照组 ;G1 %较对照组降低 ,反映细胞增殖活力的增殖指数 Pr I值 (S+ G2 M) %增高。结论 :提示 BMP具有促进人 PDL C增殖的作用 ,可能主要是通过促使处于G1 期的细胞进入 S期来实现的。

联合法体外分离培养牙周膜细胞的研究

目的该研究采用将牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)培养中经典的组织块法和酶消化法结合起来的联合法进行PDLCs分离培养,旨在寻找一种简单易行的PDLCs培养模式,缩短牙周膜原代细胞培养周期.方法取25颗因正畸需要拔除的完整双尖牙,运用联合法进行牙周膜原代细胞的提取培养,计算成功率.结果采用联合法分离培养可获得PDLCs,所得的PDLCs呈长梭形,符合PDLCs的形态和生物学特征,长势良好,其成功率为40%.结论运用联合法提取培养PDLCs的方法可行,所得细胞形态及长势良好.