杠柳毒苷理化性质研究

目的为中药单体杠柳毒苷制剂的开发提供科学的参考依据及技术支持。方法以杠柳毒苷为研究对象,考察了杠柳毒苷的溶解度、引湿性、稳定性。结果在pH1.0~8.0之间的介质中的杠柳毒苷溶解度存在一定的pH依赖性,且均属于微溶;具有引湿性;在高温、高湿、酸的条件下均不稳定,在氧化、强碱及光照条件下较为稳定;金属离子影响溶液稳定性。结论本研究可为杠柳毒苷的制剂开发提供参考。

香加皮杠柳苷通过溶酶体途径诱导胃癌MGC-803细胞凋亡

目的探讨香加皮杠柳苷(periplocin extracted from cortex periplocae,CPP)是否通过溶酶体途径诱导胃癌细胞凋亡。方法 200、100、50 ng/ml香加皮杠柳苷作用于MGC-803细胞24和48 h后,MTS法检测细胞的增殖情况,用TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot检测不同浓度香加皮杠柳苷作用于MGC-803细胞24 h后Caspase-3和Caspase-9的表达情况,吖啶橙染色检测溶酶体释放情况,免疫荧光法检测组织蛋白酶B(Cathepsin B)的表达变化情况。结果与空白对照组相比,50、100、200 ng/ml香加皮杠柳苷作用于MGC-803细胞24、48 h后,均具有增殖抑制作用,24 h增殖率分别为[(66.43±1.67)%、(55.39±3.63)%、(37.06±0.57)%vs.(100.14±8.49)%,P均<0.05],48 h增殖率分别为[(38.16±3.26)%、(32.00±1.83)%、(24.75±1.57)%vs.(100.33±8.98)%,P均<0.05]。与空白对照组相比,50、100、200 ng/ml香加皮杠柳苷作用于MGC-803细胞24 h后,细胞凋亡率显著增加,凋亡率为[(28.56±6.96)%、(33.70±4.60)%、(60.42±4.48)%vs.(2.23±1.03)%,P均<0.05],Caspase-3的活性裂解片段和Caspase-9表达量升高,溶酶体膜的完整性被破坏,Cathepsin B由溶酶体释放到细胞质中。结论香加皮杠柳苷可通过溶酶体途径诱导胃癌细胞凋亡。

杠柳不同部位的杠柳毒苷含量

目的:测定杠柳不同部位的杠柳毒苷含量。方法:采用HPLC法,ODS色谱柱,流动相为乙腈∶水=27∶73,检测波长220 nm。结果:杠柳的根皮、茎皮、根的木质部和茎的木质部的杠柳毒苷含量分别为1.03%、0.65%、0.26%、0.39%;杠柳的叶及果实未检出杠柳毒苷。结论:杠柳植物可综合利用。

香加皮杠柳苷对荷瘤小鼠的免疫调节作用

目的:研究香加皮杠柳苷(CPP)对荷瘤小鼠的免疫调节作用及其作用机制。方法:建立BALB/c小鼠H22皮下移植瘤,观察低、中、高剂量CPP(0.25、0.50、1.00mg/kg)对荷瘤小鼠免疫器官的影响,应用流式细胞术检测各组小鼠脾T淋巴细胞亚群的分布,应用MTT法检测ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖活性,用ELISA试剂盒测定各组荷瘤小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-2和IL-12的含量。结果:对照组荷瘤小鼠的胸腺指数及脾脏指数均明显低于未荷瘤正常小鼠(P<0.05),而CPP组荷瘤小鼠的胸腺指数及脾脏指数较对照组明显增高,甚至高于正常对照组(P<0.05)。CPP对荷瘤小鼠体内CD8+T细胞数量无影响,但可明显上调CD3+、CD4+T细胞数及CD4+/CD8+比值,其中CD3+、CD4+细胞百分率与正常小鼠无差别(P>0.05),CD4+/CD8+比值高于正常小鼠(P<0.05)。CPP可明显增强ConA诱导的荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖能力,SI甚至超过正常对照组(P<0.05)。不同剂量CPP组小鼠血清中TNF-α、IL-2和IL-12水平均较对照组明显增高(P<0.05),并随剂量增加呈升高趋势,至接近或超过正常小鼠水平。结论:CPP可保护荷瘤小鼠的免疫器官不受损害,并可明显提高CD4+T细胞百分率和CD4+/CD8+比值,增强荷瘤小鼠T细胞增殖能力,促进细胞因子TNF-α、IL-2和IL-12的产生,表明CPP具有显著的免疫增强作用。

香加皮杠柳苷诱导人食管癌细胞凋亡及其作用机制的研究

目的:探讨中药香加皮醇提物杠柳苷诱导人食管癌细胞凋亡及其作用机制。方法:应用MTT法检测香加皮醇提物杠柳苷对食管癌细胞TE-13、Eca-109、TE-1和TE-10增殖的影响,并计算其对食管癌细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50);在光学显微镜下观察经杠柳苷处理后细胞的形态学改变;Wright-Giemsa染色观察Eca-109细胞凋亡的形态学变化;FCM检测杠柳苷对Eca-109细胞凋亡的影响;RT-PCR法检测经杠柳苷处理后细胞凋亡相关基因mRNA表达的改变;caspase-3/7蛋白酶活性检测试剂盒检测细胞caspase蛋白酶活性的变化。结果:香加皮醇提物杠柳苷对人食管癌细胞的增殖具有明显的抑制作用;经杠柳苷处理后,Eca-109细胞出现明显的凋亡形态学变化,与未处理组比较,细胞凋亡率明显上升(P<0.05);经杠柳苷处理后,Eca-109细胞中survivin和bcl-2 mRNA的表达下调(P<0.05),bax mRNA的表达水平升高(P<0.05),xiap、caspase-3和caspase-7 mRNA的表达水平无明显变化,而caspase-3/7蛋白酶活性明显增加(P<0.05)。结论:杠柳苷可明显抑制食管癌细胞的增殖,其作用机制可能是通过下调凋亡抑制基因的表达而诱导细胞凋亡。

香加皮杠柳苷对人肺癌QG56细胞抑制作用的研究

目的：研究香加皮杠柳苷（CPP）对人肺癌QG56细胞的抑制作用及其作用机制。方法体外培养人肺癌QG56细胞，设对照组和终浓度为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μg/L的CPP（CPP 1~5）组，每组设3个平行孔，分别培养24、48、72 h。采用MTT法检测CPP对QG56细胞增殖的影响；倒置显微镜观察CPP处理前后细胞形态变化；流式细胞术检测细胞凋亡和周期分布；RT-PCR法检测CPP作用后QG56细胞中凋亡相关基因bax mRNA表达情况；免疫细胞化学法检测CPP对QG56细胞bax蛋白表达的影响。结果随CPP浓度的增加、作用时间的延长，细胞增殖抑制率明显增高。显微镜下可见CPP处理后的QG56细胞变圆，皱缩，呈悬浮状态。随CPP浓度的增加，G0/G1期细胞比例增高，而S期和G2/M期细胞比例减少, QG56细胞凋亡率明显增高。CPP 2组经CPP作用48 h后，细胞凋亡率高于对照组，CPP 3组经CPP作用24 h后，细胞凋亡率均高于对照组，CPP 4组经CPP作用12 h后，细胞凋亡率均高于对照组（均P＜0.05）。CPP 2~4组经CPP作用48 h时QG56细胞中bax mRNA和蛋白的表达明显增强。结论 CPP可通过阻滞细胞周期和诱导凋亡发挥对人肺癌QG56细胞的抑制作用。

HPLC法同时测定香加皮中杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛的方法改进

[目的]建立同时测定香加皮中杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛含量的方法。[方法]采用高效液相色谱(HPLC)法,ODS色谱柱,流动相为乙腈∶甲醇∶水=27∶10∶63,检测波长220nm。[结果]杠柳毒苷线性范围0.08～1.0μg,r=0.9993;4-甲氧基水杨醛线性范围0.22～3.0μg,r=0.9999;杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛精密度的峰面积(RSD)值分别为0.79%、0.67%,重现性的RSD值分别为1.2%、2.2%,加样回收率分别为97.1%、96.2%。[结论]本法可同时测定香加皮中杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛的含量,分析时间短,且改进方法的准确度和重现性要优于文献报道方法。

香加皮杠柳苷对MCF-7细胞周期及p21^(WAF1/CIP1)表达的影响

目的研究香加皮杠柳苷(CPP)对人乳腺癌MCF-7细胞周期及p21WAF1/CIP1表达的影响,探讨其抗肿瘤作用及作用机制。方法采用MTT法检测不同浓度CPP(1.25、2.50、5.00、10.00、20.00ng/ml)作用不同时间(24、48、72h)对MCF-7细胞的增殖抑制作用;应用流式细胞术分析不同浓度CPP(2.50、5.00、10.00ng/ml)分别作用于MCF-7细胞6、12、24、48、72h对肿瘤细胞周期的影响;并采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测细胞周期相关因子p21WAF1/CIP1的表达。结果 CPP能明显抑制MCF-7细胞的增殖,并呈浓度及时间依赖性,作用于MCF-7细胞48h的IC50为(4.88±0.16)ng/ml。流式细胞术结果显示,CPP作用MCF-7细胞24h时,G0/G1期细胞明显增多,而S期和G2/M期细胞显著减少,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),其中5.00ng/ml组G0/G1期细胞由对照组的(49.33±3.25)%升高至(79.47±2.40)%,S期和G2/M期细胞由对照组的(28.47±1.59)%和(22.20±2.09)%分别下降至(10.13±3.26)%和(10.40±1.41)%。经CPP处理的MCF-7细胞中p21WAF1/CIP1mRNA的表达明显增强,p21WAF1/CIP1/β-actin光吸度比值与对照组相比明显增高(P<0.05)。免疫细胞化学结果显示,CPP组MCF-7细胞中p21WAF1/CIP1蛋白的表达随作用浓度的增加而增强,其中10.00ng/ml组肿瘤细胞p21WAF1/CIP1的表达呈强阳性。结论香加皮杠柳苷(CPP)具有显著的体外抗肿瘤作用,且有效剂量很小,其IC50仅为(4.88±0.16)ng/ml。CPP可使MCF-7细胞发生G0/G1期阻滞,并可使细胞周期相关基因p21WAF1/CIP1的mR-NA及蛋白表达增强,提示阻滞细胞周期可能是CPP体外抗肿瘤的作用机制之一。

杠柳苷对人食管癌细胞增殖的抑制作用及与Rb蛋白表达的关系

背景与目的:分析中药香加皮醇提物杠柳苷(CPP)对食管癌细胞株TE-13的生长抑制作用,探讨其诱导细胞凋亡和周期阻滞与Rb蛋白表达的关系。材料与方法:取对数生长期的人食管癌细胞TE-13,接种于96孔培养板,分为实验组、阴性对照组和阳性对照组。实验组加入不同浓度的CPP,阴性对照孔加入完全培养基,阳性对照孔加入化疗药物羟甲基喜树碱,应用MTT法检测CPP对TE-13细胞的抑制作用;光镜下观察TE-13细胞的形态学变化;流式细胞技术检测细胞凋亡率;免疫组化法检测TE-13细胞经药物处理前后去磷酸化Rb蛋白表达的变化。结果:CPP对TE-13细胞增殖具有明显的抑制作用(P<0.01),其药物浓度越大,作用时间越长,抑制效应越强;CPP作用48 h时,对TE-13细胞的半数抑制浓度(IC50)为0.61μg/ml。出现亚二倍体和凋亡峰(Ap);CPP能提高TE-13细胞中Rb蛋白的表达(P<0.01)。结论:CPP能显著抑制TE-13细胞的增殖,促进其凋亡,其作用机制可能与CPP提高Rb蛋白的表达有关。

香加皮提取物杠柳苷抑制SMMC-7721细胞Stat3信号通路诱导细胞凋亡的研究

目的研究香加皮提取物杠柳苷对Stat3信号通路的影响,及其诱导细胞凋亡的分子机制。方法MTT比色法检测人肝癌细胞SMMC-7721增殖活性,流式细胞术分析肿瘤细胞的周期变化和凋亡,Western blot检测细胞内Stat3蛋白表达,RT-PCR检测细胞Mcl-1、Survivin和XIAP mRNA的表达。结果杠柳苷可明显抑制SMMC-7721细胞的增殖,诱导SMMC-7721细胞凋亡,并使细胞周期停滞在G2/M期。杠柳苷作用后,细胞核内Stat3量降低,而细胞质中的量未见明显改变,细胞内Mcl-1、Survivin和XIAP基因的表达明显降低,并呈时间依赖性。结论香加皮提取物杠柳苷通过抑制Stat3信号转导通路和Mcl-1、Survivin和XIAP mRNA的表达,进而抑制SMMC-7721细胞的增殖,诱导其凋亡。

香加皮杠柳苷抑制Stat5信号通路诱导SMMC-7721细胞凋亡的实验研究

目的研究香加皮提取物杠柳苷对Stat5信号通路的影响,探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制。方法MTT比色法检测细胞增殖活性,流式细胞术观察肿瘤细胞的周期变化和凋亡,western blot法检测杠柳苷作用前后人肝癌细胞株SMMC-7721细胞内Stat5蛋白质表达。结果杠柳苷明显抑制SMMC-7721细胞的增殖,使细胞周期停滞在G2/M期,并能够诱导SMMC-7721细胞凋亡。杠柳苷作用后,细胞核内的Stat5蛋白量降低而胞浆中的量未见明显改变。结论香加皮杠柳苷能够抑制Stat5信号转导通路,进而抑制SMMC-7721细胞的增殖并诱导其凋亡。

香加皮杠柳苷通过抑制Wnt/β-catenin信号通路诱导结肠癌细胞SW480凋亡

背景与目的:Wnt/β-catenin信号通路在人类肿瘤尤其在大肠癌的发生发展中起着重要作用。本研究分析了香加皮杠柳苷(periplocin extracted from cortex periplocae,CPP)对人结肠癌细胞SW480增殖的抑制作用,及对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。方法:MTT法检测CPP对SW480细胞增殖的影响,流式细胞技术检测细胞周期的变化和凋亡。Western blot法检测CPP处理组与对照组细胞总蛋白、细胞浆蛋白及细胞核蛋白中β-catenin表达变化,电泳迁移率改变法分析CPP作用后SW480细胞核TCF复合物与其特异性DNA结合序列结合能力变化。半定量RT-PCR法检测CPP作用后细胞中β-catenin、survivin、c-myc和cyclin D1 mRNA的表达。结果:CPP明显抑制SW480细胞增殖(P<0.01),并呈时间和浓度依赖性;0.5μg/mLCPP可将SW480细胞阻滞于G0/G1期,并诱导细胞凋亡(P<0.05)。CPP作用后SW480细胞总蛋白、胞浆蛋白及细胞核蛋白中的β-catenin表达均明显降低(P<0.01),细胞核中TCF复合物与其特异性DNA结合序列结合能力受到抑制,其下游靶基因mRNA表达水平下降(P<0.01),而β-catenin mRNA表达未见明显改变。结论:CPP可明显抑制SW480细胞增殖并诱导细胞凋亡,其作用机制与抑制细胞Wnt/β-catenin信号转导通路有关。

RP-HPLC法同时测定香加皮中杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛的含量

目的:建立同时测定香加皮中杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛含量的方法。方法:采用 Kromasil C_(18)柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-水(28:72)为流动相,流速1.0 mL·min^(-1),检测波长220 nm,对所收集的13批香加皮药材的杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛进行同时含量测定。结果:杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛的线性范围分别为0.012～0.054 mg·mL^(-1)(r=0.9994)和0.018～0.203 mg·mL^(-1)(r=0.9993),平均回收率(n=9)分别为101.0%和101.9%。结论:不同产地香加皮药材中杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛的含量存在较大差异,所建立的测定方法简便、重复性好,为香加皮药材的质量评价提供方法。

香加皮最大耐受量给药小鼠体内杠柳毒苷及苷元的代谢

目的研究最大耐受量下香加皮中杠柳毒苷及苷元在小鼠体内的代谢规律。方法小鼠单次腹腔注射给予最大耐受量的香加皮水提物,高效液相色谱法测定给药后不同时间点血浆及心脏组织中杠柳毒苷及苷元的浓度。结果小鼠给药后,血浆中杠柳毒苷及杠柳毒苷苷元均出现多峰,其中杠柳毒苷在0～45 min时间段为吸收相,符合零级动力学,拟合方程为C=0.320 t,在45 min和120 min出现两个高峰,120～720 min时间段符合二室模型,t1/2α=1.694 min,t1/2β=344.049 min。在药后12 h内心脏组织中杠柳毒苷及杠柳毒苷苷元的含量相对稳定,没有显著降低。结论杠柳毒苷及苷元在体内存在肝肠循环,且苷元吸收较快;杠柳毒苷及苷元在心脏内有一定的蓄积。

香加皮有效部位滴丸的质量标准研究

[目的]建立香加皮有效部位滴丸的质量标准。[方法]建立了高效液相色谱(HPLC)法进行杠柳毒苷含量测定和杠柳毒苷的均匀度检查;对滴丸剂进行了常温下的初步稳定性考察。[结果]香加皮有效部位滴丸含量测定方法学考察的指标均符合有关规定;滴丸均匀度符合要求。[结论]建立了有效部位及滴丸的质量标准,方法简便、可靠。滴丸剂质量基本稳定。

大孔树脂纯化香加皮提取物的工艺考察

[目的]考察香加皮提取物的大孔树脂纯化工艺。[方法]以杠柳毒苷为指标,进行树脂型号的选择、上样量的确定、洗脱溶剂的选择,考察了上样液浓度、柱径高比对吸附的影响等。[结果]选择AB-8大孔树脂,上样生药质量与树脂体积比为1∶2,洗脱溶剂4倍量为70%乙醇,在一定范围内上样液质量浓度、柱径高比对吸附无显著影响。[结论]可以应用AB-8大孔树脂纯化香加皮提取物。

香加皮急性毒性与其杠柳毒苷含量相关性研究

目的分析香加皮的急性毒性与其中杠柳毒苷含量的相关性。方法 HPLC测定6批香加皮提取物中杠柳毒苷和4-甲氧基水杨醛的含量;小鼠分别灌胃给予6批香加皮提取物32 g膏/kg,4-甲氧基水杨醛200、250、300 mg·kg-1,观察14天内的毒性反应及死亡情况。结果小鼠灌胃给药后14天,香加皮125.7g生药/kg(含杠柳毒苷159.552mg·kg-1),106.6 g生药/kg(含杠柳毒苷112.032 mg·kg-1),111.7g生药/kg(含杠柳毒苷91.584 mg·kg-1),123.8 g生药/kg(含杠柳毒苷93.794 mg·kg-1),106.6 g生药/kg(含杠柳毒苷46.784 mg·kg-1),122.6 g生药/kg(含杠柳毒苷98.976 mg·kg-1)组死亡率分别为70%、20%、0、0、0、20%,用杠柳毒苷的量与死亡率做回归考察相关性,相关系数R2为0.9678;4-甲氧基水杨醛300 mg·kg-1组无死亡。结论柳毒苷含量与香加皮急性毒性实验结果有较好的相关性,杠柳毒苷含量的限定,可以较好的限制香加皮的毒性。

香加皮杠柳苷对肺癌A549细胞凋亡及Survivin表达的影响

目的研究香加皮杠柳苷(CPP)对人肺癌A549细胞凋亡及survivin表达的影响,探讨其抗肿瘤作用及作用机制。方法采用噻唑蓝(MTT)法检测1.25,2.50,5.00,10.00,20.00 ng·m L-1CPP处理24,48,72 h对人肺癌A549细胞的抑制作用;应用流式细胞术分析不同浓度CPP(2.50,5.00,10.00 ng·m L-1)分别作用于A549细胞6,12,24,48,72 h对细胞凋亡和凋亡率的影响;应用吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)荧光染色法和透射电镜观察CPP处理前后A549细胞凋亡的形态学及超微结构变化;采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测CPP作用后A549细胞中凋亡抑制基因survivin的mRNA表达情况;应用Western blot检测CPP对A549细胞survivin蛋白表达的影响。结果 CPP能显著抑制人肺癌A549细胞的生长,最大抑制率(93.46±2.35)%。流式细胞术结果显示,CPP处理组可见典型的凋亡峰,与对照组比较,A549细胞的凋亡率明显升高(P<0.05)。荧光显微镜下可见CPP处理组A549细胞呈橘红色的凋亡细胞形态。透射电镜下可见经CPP处理的A549细胞体积变小,出现细胞质凝缩,核内染色质凝聚边集于核膜,内质网扩张,细胞质空泡化等凋亡细胞的特征性超微结构改变。RT-PCR结果显示,经CPP处理的A549细胞中survivin mRNA表达降低(P<0.05),10.0 ng·m L-1CPP组survivin mRNA表达由对照组的(0.928±0.016)降至(0.251±0.012);Western blot结果显示CPP组细胞中survivin蛋白表达明显减弱。结论 CPP可诱导人肺癌A549细胞发生凋亡,可通过下调survivin基因的mRNA和蛋白表达而发挥诱导细胞凋亡作用。

一测多评法用于香加皮药材质量标准的研究

目的测定香加皮药材中C21甾体皂苷类7种成分的含量,初步建立香加皮药材质量标准。方法采用一测多评法,以杠柳苷A为内参物,根据杠柳苷K、杠柳苷R、杠柳苷E、杠柳苷D、杠柳苷Q、杠柳苷O与杠柳苷A相对校正因子,计算7种C21甾体皂苷类成分的含量,同时监测杠柳毒苷的含量。结果多数香加皮药材中总皂苷含量在2.0~3.5 mg·g^(-1)之间,杠柳毒苷含量在0.4~0.8 mg·g^(-1)之间。不同产地的香加皮中山西、甘肃和河南的香加皮总皂苷含量较高,四川、河北、安徽的香加皮总皂苷含量都较低,而甘肃的香加皮含量差异较大。结论该方法有效节约成本、操作简单、快捷高效,可作为香加皮多指标成分测定的质量控制方法。

香加皮杠柳苷对结肠癌细胞SW480体内外生长的影响

背景与目的:观察香加皮杠柳苷(periplocin extracted fromcortex periplocae,CPP)对人结肠癌细胞SW480体内外生长的抑制作用。材料与方法:应用MTT法检测CPP不同浓度(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μg/ml)处理SW480细胞后,对细胞增殖的影响;并于CPP(0.5μg/ml)处理SW480细胞24 h后用光学显微镜及透射电镜观察细胞凋亡形态学变化;免疫细胞化学检测细胞Survivin蛋白表达变化。采用裸鼠移植瘤模型进行体内移植瘤抑制实验。以上各实验均设立对照组。结果:与对照组比较,CPP对SW480细胞增殖具有明显的抑制作用(P<0.01),并呈剂量和时间依赖效应;CPP处理SW480细胞后,细胞出现典型的细胞凋亡形态学改变;CPP可明显下调SW480细胞survivin蛋白表达阳性率和表达水平(P<0.01);以30 mg/kg CPP对SW480细胞裸鼠移植瘤进行治疗后,荷瘤小鼠的肿瘤重量和体积均被明显抑制,抑瘤率为61.41%(P<0.01)。CPP治疗组小鼠的移植瘤组织出现明显炎性细胞浸润和坏死性变化。结论:CPP对人结肠癌细胞SW480的体内外生长均具有明显抑制作用,其作用机制可能与抑制细胞survivin蛋白表达、诱导细胞凋亡有关。