甲基对硫磷的酶联免疫吸附分析(ELISA)研究

根据甲基对硫磷的结构特征,从甲基对硫磷的甲氧基部位连接了两种间隔臂,合成了两种半抗原,并通过活性酯法和混合酸酐法分别制备了与不同的载体蛋白偶联的人工抗原。采用其中两种结合物进行动物免疫,得到了针对两种抗原的高效价抗体。在此基础上,建立了两种甲基对硫磷的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。结果表明,该方法检测限分别为2.0和6.1ng·mL-1。两种抗体对甲基对硫磷表现了很高的特异性,除了对硫磷以外,对结构相似的几种有机磷农药均无交叉反应。土壤和河水中的添加回收实验结果表明,采用ELISA方法得到的回收率及CV值都与GC方法基本吻合,且检测灵敏度比GC还高,符合农药残留分析的要求。

间接竞争性ELISA检测甲胺磷残留

采用制备的兔抗血清建立了甲胺磷 (methamidophos,MTP)残留的间接竞争性ELISA方法 ,证明了抗血清的特异性较好 ,并确立了测定参数 :抗血清与包被抗原的最佳工作浓度分别为 1∶30 0 0和 1∶5 0 0 0 ;最适检测范围为 0 .0 1～ 0 .1μg/ml;批内变异系数 7.5 6 % ,批间变异系数 5 .70 %。

拟除虫菊酯类农药多残留直接竞争ELISA建立及初步应用

以辣根过氧化物酶对兔抗拟除虫菊酯类农药抗体进行标记，通过优化分析条件和样品前处理方法，建立了可同时检测蔬菜中多种拟除虫菊酯类农药的直接竞争抑制ELISA方法（DC-ELISA），并在实际检测中进行了初步应用。该方法可用于同时检测蔬菜中甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯4种农药的残留，检出限（I10）分别为0．25、0．30、0．43、0．81mg·L^-1，青菜样品添加含量为0．5-5．0mg·kg^-1，回收率分别为93％-114％，97％-110％，89％-126％，93％-113％。采用该方法对南京市场抽取的107个样品进行检测，并与气相色谱法进行比较，直接竞争ELISA阳性检出率为8．46％，气相色谱法阳性检出率为3．74％。

对硫磷ELISA异源分析模式比较研究

为探讨方法模式对异源ELISA法各分析参数的影响情况及影响机理,设计并合成了4种与对硫磷结构相似的竞争半抗原,通过建立不同模式的同源与异源ELISA分析法,比较了不同模式下的抗原抗体用量、灵敏度、检测限及不同样品添加回收率。结果表明,异源分析对抗原和抗体的用量比同源分析有所增加,但异源分析可大大提高方法的检测灵敏度。在异源分析中,直接竞争包被抗原的ELISA(CC模式)方法重现性较差;直接竞争包被抗体的ELISA(AC模式)抗原抗体用量最多,检测灵敏度较低;间接竞争ELISA法(IC模式)具有较好的检测灵敏度,抗环境和基质干扰的能力较强,为异源ELISA分析中较优的模式。

间接竞争ELISA法测定稻田土壤中除草剂毒莠定的残留量

通过对反应体系中酶标二抗（辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG）和抗体的最佳稀释浓度等条件的筛选和确定,最终建立了一种快速灵敏地测定污染稻田土壤中毒莠定残留量的方法--间接竞争ELISA分析方法.结果表明,酶标二抗和抗体的最佳稀释度均为1：500（体积比）,毒莠定的检出下限达到5 ng·mL^-1,在0.07～0.7μg·mL^-1浓度范围内有良好的线性;土壤浸出液加样的平均回收率为104.11%,变异系数在3.13%～11.13%之间,符合农药残留分析的要求;样品基质对检测结果没有干扰.

ELISA及电化学法检测藠头中氨基甲酸酯类农药残留

建立了克百威ELISA检测技术,配合电化学法对200份出口藠头样品进行氨基甲酸酯类农药残留检测。ELISA法对克百威的最低检测限达10-7g/L,检出10例,检出率5﹪;电化学法检测,对乙酰胆碱酯酶抑制率超过60%的样品有7例,检出率3.5%。对比分析检测结果得出2种方法检测结果基本吻合。

均匀设计在ELISA分析方法条件优化实验中的应用

以对硫磷为对象,通过与常规方法相比较,对均匀设计法在ELISA分析方法条件优化实验中应用的适用性进行了研究。采用常规方法对对硫磷ELISA分析方法条件优化的结果为:甲醇体积分数为5%,离子强度0.50mol/L和pH7.40,此时建立的ELISA方法IC50值为89.17ng/mL,IC20值为12.49ng/mL。而采用均匀设计法对对硫磷ELISA分析方法条件进行优化,并对实验结果进行多元二项式统计回归,预测了最佳条件组合的取值,并进行了ELISA实验验证,结果表明:当甲醇体积分数为10%、离子强度为2.00mol/L、pH为5.00时,建立的ELISA方法的IC50值为9.96ng/mL,IC20值为1.21ng/mL。将两种方法应用于5种性质不同的环境土壤中对硫磷的检测,结果表明,采用均匀设计法进行ELISA分析方法条件优化实验快速简便,能够筛选得到最优条件组合,建立的ELISA方法具有更好的广谱性,能够更广泛地应用于基质差异较大的同类样品检测。

ELISA在农药残留检测中的应用与质量控制

对ELISA(酶联免疫吸附测定法)的反应类型及其在农药残留检测中的应用进行了概述,并对ELISA用于农药残留检测质量控制过程中存在的问题作了重点讨论。

兔抗甲胺磷多克隆抗体的制备

采用水溶性碳化二亚胺法 (EDC) ,将MTP与牛血清蛋白 (BSA)、人血清蛋白 (HSA)和鸡卵清蛋白(OVA)共价偶联 ,分别合成免疫抗原MTP BSA、MTP HSA和包被抗原甲胺磷 鸡卵清蛋白 (MTP OVA) ,用合成的免疫抗原对新西兰大白兔进行免疫 ,制得抗血清经鉴定确证为兔抗MTP多克隆抗体 (polyclonalantibody ,PAB) ,效价分别为 1∶15 0 0 0和 1∶12 0 0 0。

拟除虫菊酯类农药多残留酶免疫分析方法的建立

以间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原,与牛血清蛋白偶联后免疫新西兰大白兔,获得对多种菊酯类农药有特异性的广谱性抗体。以6-氨基己酸法合成PBA与OVA之间含有六碳骨架的桥的偶联物作包被原,建立并优化了间接竞争ELISA检测方法,对PBA最低检出限达0.193μg·ml-1,抑制中浓度为3.707μg·ml-1,且对氯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯均有特异性识别,对氰戊菊酯识别弱,抑制中浓度分别为4.066、4.232、4.286、4.874、8.979、77.360μg·ml-1。结果表明,该抗体可用于多种菊酯类农药残留筛选检测。

微生物降解蔬菜残留农药研究

从富集培养物中筛选到以甲胺磷为唯一碳源生长的菌株ＮＭＪ５和以乐果为唯一碳源生长的菌株ＮＭＬ３，经鉴定分别为芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｕｓｓｐ．）和假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）．它们利用甲胺磷、乐果生长的最适条件及在无机盐培养基中农药最大耐受浓度分别为ｐＨ７．５，ｔ＝３５℃，ρ＝１０００ｍｇ／Ｌ和ｐＨ７．５，ｔ＝３０℃，ρ＝２０００ｍｇ／Ｌ．在无碳基础培养基内单菌株培养８ｄ，５２４ｍｇ／Ｌ的甲胺磷好气降解４２．５％，厌气降解３５．９％，２５０ｍｇ／Ｌ的乐果好气降解５０．２％，厌气降解１６．４％．小区试验表明，ＮＭＪ５、ＮＭＬ３的菌液制剂对普通白菜的变种南农矮脚黄（Ｂｒａｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓＴｓｅｎｅｔＬｅｅ）中残留的甲胺磷、乐果有明显的去除作用．

次氯酸钙对蔬菜上甲胺磷农药残留降解的研究

以未污染的新鲜油菜叶为原料,采用正交实验的方法,对次氯酸钙降解甲胺磷农药的适宜条件及其对油菜品质的影响进行了研究。实验结果表明,次氯酸钙对蔬菜上的残留甲胺磷农药有较强的降解作用,其适宜作用条件为:次氯酸钙浓度为300mg/L,作用时间为20min,pH=4,在此条件下酶抑制率达到28.27%;或次氯酸钙浓度为300mg/L,作用时间为10min,pH=4,酶抑制率<33.64%。

农药残留酶联免疫吸附分析技术研究进展

酶联免疫吸附分析法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷的特点,在现场筛选和大量样品的快速检测中显示了其独特的优势。简要介绍了农药残留酶联免疫吸附分析技术的关键环节及其应用,并对该技术存在的问题和应用前景进行了讨论。

氯菊酯农药间接酶联免疫吸附测定法的建立

为测定环境样品中氯菊酯农药残留，用活泼酯法将氯菊酯半抗原（Py）与卵白蛋白（OVA）偶联，制备合成抗原Py-OVA作包被原，建立间接竞争酶联免疫吸附测定法．方阵滴定确定了抗血清最佳稀释度（1：2500），包被抗原的最适工作浓度0．45μg／mL，并建立了标准工作曲线．工作曲线表明在10-800μg／L浓度范围内呈良好的线性关系，回收率〉97％．

农药残留的酶联免疫检测技术研究进展

简要介绍了农药残留的酶联免疫分析的技术原理、关键技术环节 ,综述了国内外的酶联免疫测定农药残留的研究动态 。

酶联免疫吸附分析法测定黄瓜中的甲基对硫磷

采用自制多克隆抗体,考察了不同离子强度和不同甲醇含量对竞争反应的影响,并对反应体系进行了优化,最终建立了黄瓜中甲基对硫磷的残留检测ELISA方法。实验表明,甲基对硫磷对抗体竞争性结合的I50为0.13mg/L,方法检出限I20为6.7μg/L。除倍硫磷与杀螟硫磷表现了一定的交叉反应外,其它结构相类似的有机磷农药均无交叉反应。黄瓜样品经简单前与处理后分别采用ELISA和GC测定,用ELISA方法测得黄瓜中甲基对硫磷的添加回收率为83.10%￣93.46%,C.V为6.61%￣10.36%,最低检出限为0.003mg/kg,与GC测定数据基本相符,符合农药残留分析的要求。

酶联免疫吸附分析法测定土壤中的毒死蜱

采用自制多克隆抗体,考察了pH值和甲醇含量对竞争反应的影响,并对反应体系进行了优化,最终建立了土壤中毒死蜱的残留检测ELISA方法.试验表明,毒死蜱对抗体竞争性结合的I50为76.8 μg/L, 方法检出限为5.2 μg/L.土壤样品经简单前处理后,分别采用ELISA和GC测定,用ELISA方法测得土壤中毒死蜱的添加回收率为80.33%～83.36%,CV为5.28%～9.83%,最低检出限为 0.005 mg/kg,与GC测定结果基本相当,符合农药残留分析的要求.

单克隆抗体酶免疫分析法测定大米中杀虫脒残留量

用抗杀虫脒单克隆抗体为试剂，建立了间接竞争法、直接竞争法和标记抗原的竞争法等３种测定大米中杀虫眯残留量的ＥＬＩＳＡ法，标准曲线上抑制率为５０％时对应的杀虫眯浓度分别为１．３、１．７和５．３ｎｇ／ｍｌ。大米样品用甲醇提取，提取液经吸附剂柱简单净化后即可用上述ＥＬＩＳＡ对痕量杀虫眯进行定量。使用直接竞争法时，样品加标回收率为９０％－１１６％，平行测定的相对标准偏差为５．ｌ％－１６％，方法检出限为０．５ｎｇ／ｇ。笔者还对孵育介质ｐＨ和温度、提取剂及样品基体等因素对定量曲线的影响进行了研究和讨论。

对硫磷酶联免疫吸附分析方法的建立和评价

通过制备对硫磷的多克隆抗体,建立了对硫磷的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(icELISA)。通过活泼酯法将半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,获得免疫抗原和包被抗原。使用对硫磷抗血清,经优化条件参数建立了对硫磷的icELISA分析方法。该方法检测线性范围为3.39～533.05ng/mL,最低检测限为0.90ng/mL,对蔬菜样品和水样品的平均添加回收率为75.6%～127.4%,能用于实际样品中对硫磷的检测。

应用全自动农残速测仪检测蔬菜中甲胺磷残留的参数优化研究

为了优化检测蔬菜中甲胺磷残留的最佳参数,以提高酶抑制法检测农药残留的灵敏度和检测速度,采用FIR型全自动农药残留速测仪,以鸡肝酯酶的抑制率为指标,比较研究了静置时间、慢推循环时间、高速进样液时间3个因素对检测灵敏度的影响,并进行正交实验和极差分析,结果表明,三因素的主次关系为静置时间>慢推时间>进样时间,确定了应用FIR型全自动农残速测仪检测蔬菜中甲胺磷农药残留的参数为:先以高速通样液1·5min,再慢推循环3min,最后再静置5min,检测灵敏度较高,样品检测时间可从17min缩短到10min。