Thermotoga petrophila普鲁兰酶基因的异源表达与酶学性质分析

通过生物信息学筛选出来源于超嗜热菌Thermotoga petrophila(DSM13995)的普鲁兰酶基因,以从德国菌种保藏中心购买的基因组作为出发材料,克隆出普鲁兰酶基因TP-pul A;通过二步PCR方法构建含有该嗜热普鲁兰酶基因的载体pET21a-TP-pul A;将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中测定其酶学性质。结果表明,TP-pul A为Ⅰ型普鲁兰酶,最适pH值为6.4,最适温度是85℃,半衰期为26.28 h,Na^+、K^+、Ca^(2+)、Mg^(2+)对其酶活性有明显的促进作用,Mn^(2+)、Co^(2+)、AL^(3+)、Fe^(3+)、SDS及EDTA对酶活性有不同程度的抑制作用,Km、Vmax、Kcat及Kcat/Km值分别为0.72 g·L-1、0.004 9 mmol·L^(-1)·s^(-1)、154.63 s^(-1)、214.76 L·g^(-1)·s^(-1)。本研究采用的生物信息学方法比传统的筛菌方法简单方便耗时短,且获得的嗜热普鲁兰酶的热稳定性好、催化效率高、对普鲁兰糖有较强的底物亲和能力,具有良好的应用前景。

源自嗜热菌的α-L-鼠李糖苷酶交联聚集体的制备及应用

研究了一种制备嗜热菌Thermotoga petrophila DSM 13995来源的α-L-鼠李糖苷酶交联聚集体的方法。试验结果表明:在酶蛋白与Pluronic F127质量比为1∶8、沉淀剂硫酸铵质量浓度为75 mg/mL、戊二醛浓度为40 mmol/L时固定α-L-鼠李糖苷酶,酶活回收率可达49.45%。以硫酸铵-戊二醛(CLEA)的常规顺序制备固定化酶(PAG-R)时,酶活回收率仅为30.87%,而在Pluronic F127-硫酸铵-戊二醛(PL-AS-GL)顺序下制备PAG-R,酶活回收率达到60.90%,固定化剩余酶活力为34 U/mL。此外,研究了固定化酶PAG-R的酶学性质,结果表明PAG-R的最适温度为90℃,最适pH为5.0,与游离酶TpeRha的酶学性质相近,但在不同温度和pH条件下PAG-R的比酶活更高。PAG-R在90℃保温3 h后剩余酶活力为77.11%,而游离酶TpeRha则完全丧失活力,说明固定化酶的温度稳定性得到了较大的提升。以芦丁为底物,比较了PAG-R与TpeRha催化芦丁生成异槲皮素的产率差异。在温度80℃、pH 6.5、加酶量4 U/mL、反应时间90 min时,PAG-R能完全转化3 g/L底物,摩尔转化率为100%,产物的生成量是游离酶的2.31倍。连续反应10次后,芦丁相对转化率仍能保持在60%以上,由此可知固定化后的鼠李糖苷酶其催化效率得到了提高,且重复使用性能良好,更有利于工业化应用。