海南恶性疟原虫分离株Pfcrt和Pfmdr1基因点突变的研究

目的分析海南省恶性疟原虫分离株氯喹抗性转运蛋白编码基因(Pfcrt)及其P-糖蛋白同系物1(Pgh1)编码基因(Pfmdr1)的点突变特征,为探讨抗性分子标记用于氯喹抗性监测提供参考。方法采用巢式PCR(nested-PCR)和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)方法,检测Pfcrt基因编码第76位氨基酸的密码子和Pfmdr1基因编码第86、1246位氨基酸的密码子发生点突变情况。按世界卫生组织(WHO)推荐的体外微量法测定恶性疟原虫对氯喹的敏感性。结果检测的36份血样中,28份成功扩增Pfcrt基因,导致第76位氨基酸由赖氨酸(K)变为苏氨酸(T)的突变型占64.3%,混合型占14.3%,野生型占21.4%;29份成功扩增Pfmdr1基因,导致第86位氨基酸由天冬酰胺(N)变为酪氨酸(Y)的突变型占3.4%,混合型占6.9%,野生型占89.7%。未发现编码第1246位氨基酸的密码子发生点突变。体外氯喹敏感试验结果显示,72.2%(26/36)分离株存在抗性。治疗前恶性疟原虫Pfcrt76T突变发生率在体外微量测定法显示的氯喹抗性与敏感株中的差异有统计学意义(P<0.05),而Pfmdr1点突变发生率在氯喹抗性与敏感株中的差异无统计学意义(P>0.05)。结论恶性疟原虫Pfcrt基因76T可以作为监测氯喹抗性的一个分子标记。

输入性恶性疟原虫耐药相关基因Pfcrt和Pfmdr1单倍型及突变分析

目的了解目前山东省输入性恶性疟原虫抗药性基因Pfcrt和Pfmdr1的单倍型,分析突变基因型及其分布情况。方法根据恶性疟原虫Pfcrt和Pfmdr1基因序列设计套式PCR引物,对采自全省非洲务工返乡的输入性恶性疟感染者血样扩增,并对其产物进行基因测序和序列对比分析。结果 68例样本Pfcrt基因第72~76位点和Pfmdr1基因第86、1 042和1 246位点目的片段全部成功扩增和测序。Pfcrt基因中69.12%为野生单倍型CVMNK,30.88%为突变单倍型,突变型包括CVIET、CVIDT及混合型,其中CVIET数量最多。Pfmdr1基因中69.12%为野生单倍型NND,30.88%为突变单倍型,即YND及混合基因型。6个非洲输入来源国样本中,除几内亚Pfcrt基因全部为野生型外,其它国家Pfcrt和Pfmdr1基因均有突变型存在。5例样本Pfcrt和Pfmdr1基因共同表现为突变单倍型。结论山东省输入性恶性疟Pfcrt和Pfmdr1基因突变单倍型具有多样化特征。Pfcrt和Pfmdr1突变型比例均低于野生型,提示目前该省流行的输入性恶性疟未出现严重的氯喹耐药性。

恶性疟原虫海南分离株pfmdr1基因与氯喹抗性的相关性分析

目的了解海南省恶性疟原虫pfmdr1基因同氯喹抗性的关系。方法采用套式PCR技术特异性扩增pfmdr1基因含有编码第86位、1042位和1246位氨基酸的基因片段,并对扩增产物进行RFLP分析。结果42个样本中,pfmdr1第86位氨基酸均未发生突变,即86位氨基酸是野生型的Asn,而不是突变型的Tyr。第1246位氨基酸发生突变的样本共有7个,全部为抗性虫株。第1042位点PCR扩增结果阳性的37个样本中突变的样本共有10个,其中9个为抗性虫株,一个为敏感虫株。结论我国海南省恶性疟原虫氯喹抗性产生与pfmdr186位氨基酸基因多态性无关,但第1042和1246位氨基酸的突变更易在抗性虫株中检出。

云南边境地区氯喹及与青蒿琥酯伍用治疗前后恶性疟原虫pfcrt和pfmdr1抗药性有关基因点突变的变化特征(英文)

目的 了解氯喹单用及与青蒿琥脂伍用治疗恶性疟前后 ,pfcrt和 pfmdr1抗药性有关基因的点突变变化特征。 方法 使用PCR RFLP技术检测基因点突变。 结果 氯喹及与青蒿琥脂伍用治疗前后的所有样本都发现有恶性疟原虫pfcrt基因氨基酸编码 76突变为苏氨酸的特征。但是 ,氯喹治疗前 ,5 0 % pfmdr1基因氨基酸编码 86为天冬酰氨酸 (野生型 ) ,而剩余的 5 0 %为野生型和突变型 (苏氨酸 )的特征。氯喹治疗后 ,在 18个复燃的病例中 ,83 .3 %的 pfmdr1基因 86位点为野生型 ,剩余的 16.7%是混合型。氯喹与青蒿琥脂伍用治疗前 ,3个样本携带混合型基因型 ,剩余的 (86% )为野生型 ,但治疗后 ,所有样本只携带野生型。 结论 这些结果可能支持这样的假说 :pfcrt基因突变起主导作用 ,但 pfmdr1基因突变增强了氯喹抗药性的效果。

氯喹抗药性与相关基因Pfmdr1

抗疟药氯喹作为安全、有效、廉价的一线抗疟药物被广泛使用。随着世界各地恶性疟原虫株氯喹抗性的产生,氯喹抗药性的机制研究已成为疟疾研究的重点之一。本文就有关氯喹抗药性与相关基因序列Pfmdr1的研究进展作一综述。

海南省恶性疟原虫氯喹抗性相关基因Pfmdr1多态性分析

目的了解海南省恶性疟原虫Pfmdr1基因中的关键性点突变是否与海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性有关。方法采用套式PCR法分别扩增Pfmdr1基因中含有第86位和1246位氨基酸的多态性片段,并对扩增产物进行限制性内切酶酶切分析,观察是否存在突变位点。结果45个样本中,Pfmdr1基因第86位氨基酸均未发生点突变,即86位密码子是Asn而非突变型的Tyr;Pfmdr1基因发生D1246Y突变的样本有3个,其中1个是抗性株,2个为敏感株。结论我国海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性与Pfmdr1基因的多态性无显著关系。

恶性疟原虫FCC1/HN(CQS)株Pfmdr1、Cg1基因T-A克隆及序列分析

目的 将恶性疟原虫FCC1/HN株 (CQS)Pfmdr1和Cg1全基因编码区克隆入测序载体 ,测定其序列 ,为以后研究其与疟原虫耐药性的关系奠定基础。方法 利用PCR扩增技术 ,分 3个片段从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中 ,特异扩增Pfmdr1全基因编码序列 ;分 2个片段特异扩增Cg1全基因编码序列。扩增产物经纯化回收后 ,T -A克隆入测序载体 pMD18-T ,转化大肠杆菌 (E coli)JM 10 9,筛选阳性克隆 ,并进行双酶切及PCR扩增鉴定 ,获得阳性重组质粒 ,用Sanger双脱氧链终止法进行DNA测定。结果 CQSFCC1/HN株Pfmdr1基因序列与CQSFc2 7株同源性高 ,全长 4 2 4 8bp ,编码 14 15个氨基酸 ;测得Cg1基因全长为 2 82 0bp ,编码 939个氨基酸 ,存在串联α重复序列。 结论 恶性疟原虫FCC1/HN(CQS)株Pfmdr1和Cg1全基因编码序列的测定 ,为以后研究耐药性虫株的上述基因以及它们与疟原虫耐药性的关系奠定基础。

中缅边境恶性疟原虫pfmdr1基因多态性及pfmsp1等位基因分型研究

目的分析中缅边境恶性疟原虫多抗药基因1（Plasmodium falciparum multidrugresist．ancel，pfmdr1）基因编码蛋白86位点多态性及裂殖子表面蛋白1（P．falciparu mmerozoite surface protein1gene，pfmsp1）等位基因的分型特征。方法采用chelex-100法提取DNA，PCR扩增pfmdr1基因编码蛋白86位点及pfmsp1基因第2区与第3区部分片段，并对其进行DNA测序，对扩增片段基因的结构、同源性进行分析。结果检钡4的50份血样中，49份成功扩增pfmdr1基因，49份在第25位氨基酸均发生缺失，且在第27—29位氨基酸由STA都突变为EYR，9份在第35位氨基酸缺失，第86位氨基酸均未发生点突变。50份恶性疟患者样本中有49份共扩增出72个pfmsp1基因片段，以MAD20型为主导型占93．88％，K1、R033型为次之，并存在不同基因株混合感染现象。结论中缅边境恶性疟原虫株pfmdr1基因第86位氨基酸点无突变，pfrrup1存在MAD20型、K1型和R033型3种等位基因型，以MAD20型为优势虫株。

恶性疟原虫氯喹抗性相关基因的研究进展

恶性疟原虫产生氯喹抗性是疟疾防治中遇到的主要难题之一。存在于恶性疟原虫5号染色体上的多药抗药性基因1(pfmdr1)和7号染色体上的cg 2基因和pfcrt基因被认为是氯喹抗性相关基因,本文就其研究进展作一综述。

云南省恶性疟原虫多药抗性基因^(Asn)86^(Tyr)多态性调查

目的检测云南恶性疟原虫多药抗性基因 (Pfmdr1 ) Asn 86Tyr的多态性 ,探索其与氯喹敏感性表现型的关系。方法用等位基因特异 PCR和限制性酶切片段长度分析技术 (AS-PCR/RFLP)。结果在 86% (1 9/2 2 )的氯喹抗性分离株中检测到 Pfmdr1基因的 Asn86Tyr两种多态性 ,携带编码 86Tyr多态变异的占 50 % ,而含编码 Asn86多态的也是 50 %。结论在云南氯喹抗性高度流行区 ,Pfmdr1基因

云南省现场恶性疟原虫3个抗药性基因点突变特征

目的 研究云南省现场恶性疟原虫 3个与抗疟药抗性有关的dhfr、pfmdr1和pfcrt的点突变特征 ,为抗药性恶性疟原虫的分子生物学研究提供背景资料。 方法 应用特异性套式多聚酶链反应 (PCR)和限制性酶切片段长度分析 (RFLP)方法 ,检测恶性疟现症病人干滤纸血样的恶性疟原虫 3个抗药性基因点突变情况。 结果 恶性疟原虫dhfr基因内 16,5 1,10 8和 164位氨基酸有不同程度的突变 ,突变型比例高 ,以Asn -10 8和Ⅰle -5 1为甚 ,频度分别为94 3 %和 81 3 %。野生型 ( 3D7型 )Ser -10 8出现较低频率 8 6% ,而AIa -16出现频率较高 68 6% ;pfcrt基因的 76位点由K突变为T ,突变型 (含混合 )占 96 7% ;野生型仅占 3 4% ;pfmdr1基因 86位点由Asn突变为Tyr ,突变型占 3 4 % ;野生型点 48 7% ;混合型占 16 7%。未发现 12 46位点突变的存在。 结论 云南现场恶性疟原虫与抗疟药抗性有关的3个pfdhfr、pfmdr1和pfcrt基因有较广泛的点突变特征。

酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹反应性的研究

目的研究酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹反应性,及其增效机制。方法恶性疟原虫氯喹抗性株(FccSM1/yN株)取自云南省思茅地区恶性疟患者静脉血,经同步化处理,用新鲜血将红细胞感染率调至0.5%～1.0%,红细胞压积与培养基体积比(红细胞比容)为1∶9,混匀。制备氯喹药板及氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)组合药板。氯喹药板自上而下每行氯喹终浓度依次为0.3125～2560nmol/L,呈2倍递增。氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)组合药板,是在氯喹药板基础上加入酮替芬(或赛庚啶),每行10孔自左至右终浓度依次为9.77～5000nmol/L,呈2倍递增,每块药板均设A行空白对照。每孔加混匀血样50μl,37℃培养34h,镜检计数每200个疟原虫中含3个核以上裂殖体数,计算氯喹单药及各配伍组对恶性疟原虫的半数抑制浓度(IC50),以及酮替芬(或赛庚啶)提高氯喹活性的指数(AEI)。选择AEI值较高的配伍组,进行增效时序性研究。当氯喹对虫体作用0～10h分别加入酮替芬(或赛庚啶),34h后检测和计算各时间段IC50及AEI。选择氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)最佳配伍剂量,培养恶性疟原虫20h,提取总RNA,用实时荧光定量PCR(real-timePCR)分析药物作用前后恶性疟原虫氯喹抗性转移基因(pfcrt)和多药抗性基因(pfmdr1)表达水平。结果0.3125～2560nmol/L氯喹与625nmol/L酮替芬(或赛庚啶)配伍,增效作用显著,氯喹/酮替芬的IC50为74.53nmol/L,AEI为0.42;氯喹/赛庚啶的IC50为89.70nmol/L、AEI为0.30。5nmol/L氯喹作用6～7h加入625nmol/L酮替芬(或赛庚啶),增效作用显著,氯喹/酮替芬的IC50为67.70nmol/L、AEI为0.47;氯喹/赛庚啶的IC50为81.53nmol/L、AEI为0.37。5nmol/L氯喹与625nmol/L酮替芬(或赛庚啶)配伍,作用20h,氯喹/酮替芬可使pfcrt基因表达水平升高91%,而氯喹/赛庚啶可使pfmdr1基因表达水平下降14%。结论体外氯喹与适量的酮替芬(或赛庚啶)配伍,能增强恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹的反应性。氯喹对虫体作用6～7h加入酮替芬(或赛庚啶)增效作用显著。该增效作用与pfcrt基因和pfmdr1基因的表达水平有关。

河南省自赤道几内亚输入的恶性疟原虫抗药性基因多态性分析

目的分析河南省自赤道几内亚输入性恶性疟原虫抗药性基因多态性,了解恶性疟原虫基因突变情况,评估其流行特征。方法收集河南省2012—2019年自赤道几内亚输入性恶性疟病例信息和外周血样,提取血样中恶性疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增恶性疟原虫Kelch 13螺旋体(PfK13)基因、恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白(Pfcrt)基因、恶性疟原虫多药物抗性基因1(Pfmdr1)、恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(Pfdhfr)基因和恶性疟原虫二氢蝶酸合酶(Pfdhps)基因,琼脂糖凝胶电泳后进行双向测序。获得的基因序列通过MEGA7软件与参考基因组进行比较获得突变位点信息,参考基因组来自GenBank的恶性疟原虫3D7野生虫株(GenBank登录号分别为PF3D7_1343700、PF3D7_0709000、PF3D7_0523000、PF3D7_0417200和PF3D7_1324800)。使用SPPS 21.0软件对数据进行统计学分析。结果2012—2019年,河南省共报告输入性疟疾病例1522例,其中自赤道几内亚输入病例117例,包括恶性疟病例97例、卵形疟病例16例、间日疟和三日疟病例各1例、恶性疟原虫/三日疟原虫混合感染和恶性疟原虫/卵形疟原虫混合感染病例各1例。测序获得91份恶性疟原虫样品的PfK13基因序列,基因突变率为8.8%(8/91);突变样品中共检测出7个非同义突变位点和3个同义突变位点,其中非同义突变位点分别为M476I混合型(混)、A481V混、A564E混、P574L混、A578S、V589I和N609I混,同义突变位点分别为G625G、N664N和C469C。测序获得91份恶性疟原虫样品的Pfcrt基因序列,基因突变率为18.7%(17/91);检测出3种Pfcrt基因型,分别为野生型C72V73M74N75K76(81.3%,74/91)、突变型C72V73I74E75T76(12.1%,11/91)和混合型C72V73M/I74N/E75K/T76(6.6%,6/91)。测序获得92份恶性疟原虫样品的Pfmdr1基因序列,基因突变率为77.2%(71/92);检测出3个突变位点,分别为N86Y(41.3%,38/92)、Y184F(75.0%,69/92)和D1246Y(1.1%,1/92),其中N86Y突变率从2012年的68.8%(11/16)下降到2016年的11.1%(1/9)(χ2=11.58,P<0.05);检测出5种Pfmdr1基因型,分别为野生型N86Y184D1246(22.8%,21/92),单基因突变型Y86Y184D1246(1.1%,1/92)、N86F184D1246(34.8%,32/92)、N86Y184Y1246(1.1%,1/92)和双重突变型Y86F184D1246(40.2%,37/92)。测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhfr基因序列,基因突变率为96.7%(87/90);检测出3个突变位点,分别为N51I(91.1%,82/90)、C59R(93.3%,84/90)和S108N(96.7%,87/90);检测出5种Pfdhfr基因型,分别为野生型N51C59S108(3.3%,3/90),单基因突变型N51C59N108(2.2%,2/90),双重突变型I51C59N108(1.1%,2/90)、N51R59N108(3.3%,3/90)和三重突变型I51R59N108(90.0%,81/90)。测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhps基因序列,基因突变率为97.8%(88/90);检测出6个突变位点,分别为I431V(8.9%,8/90)、S436A(27.8%,25/90)、A437G(92.2%,83/90)、K540E(3.3%,3/90)、A581G(1.1%,1/90)和A613S(2.2%,2/90);检测出8种Pfdhps基因型,分别为野生型I431S436A437K540A581A613(2.2%,2/90),单基因突变型I431A436A437K540A581A613(5.6%,5/90)、I431S436G437K540A581A613(66.7%,60/90),双重突变型I431A436G437K540A581A613(10.0%,9/90)、I431S436G437E540A581A613(3.3%,3/90),三重突变型V431A436G437K540A581A613(8.9%,8/90)、I431A436G437K540G581A613(1.1%,1/90)和I431A436G437K540A581S613(2.2%,2/90)。89份恶性疟原虫样品的Pfdhfr和Pfdhps基因同时测序成功,其中84例(94.4%)同时发生双基因突变,四重突变体I51R59N108⁃G437占比最高(64.0%,57/89)。结论自赤道几内亚输入的恶性疟原虫样品中检出多个PfK13基因突变位点,其中M476I和P574L已被证实与青蒿素类药物抗性相关;随着氯喹的停用,与青蒿素配伍药物抗性相关的Pfcrt和Pfmdr1基因突变率呈下降趋势;恶性疟原虫对磺胺多辛⁃乙胺嘧啶药物抗性水平多为“部分抗性”,未检出“超级抗性”样品。

境外输入性恶性疟原虫药物抗性基因多态性分析

目的了解河南省输入性恶性疟原虫相关抗性基因的突变情况。方法采集河南省2016年自非洲劳务返乡的131例输入性恶性疟患者血样,提取DNA,采用Pfdhfr、Pfmdr1和K13基因序列引物进行巢式PCR扩增并测序,对测序结果进行序列比对,分析基因突变情况。结果 131例输入性恶性疟患者自19个非洲国家务工返乡。131份血样均扩增出Pfdhfr、Pfmdr1和K13基因片段。其中Pfdhfr基因51,59和108位点氨基酸双突变NRNI型占2.29%,ICNI型占10.69%,三突变IRNI型占85.49%,野生型占1.53%,未见四突变。Pfmdr1基因86突变率分别为9.16%,K13突变率为11.45%,共15份血样检测到9个位点突变。结论 2016年河南省输入性恶性疟原虫Pfdhfr、Pfmdr1和K13基因均有不同程度的突变,其中Pfdhfr基因三突变型所占比例较高,K13基因未检测到与青蒿素抗性相关的突变。

恶性疟原虫氯喹抗性机制研究进展

目的目前疟原虫抗药性已成为全球性严重的公共卫生问题,现有的抗疟药物大部分已产生程度不同的抗药性。研究药物抗性产生的分子机制对研制新型抗疟药、降低抗性产生速率以及对抗性实施监测都具有重要意义。氯喹作为最早发现和使用的最为有效抗疟药物,在大规模用于疟疾治疗后,恶性疟原虫陆续产生对氯喹的抗药性,并且抗性虫株在全球范围迅速播散。近二十年来对氯喹作用机制和抗药性产生的分子机制的研究已取得很大进展。本文将讨论近年来有关氯喹抗性产生相关的分子机制,尤其是与抗药性密切相关的两个基因,即恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Pfcrt)与恶性疟原虫多药物抗性基因-1(Pfmdr1)的研究进展。

中缅边境地区恶性疟原虫氯喹抗性相关基因的多态性分析

目的 分析中缅边境地区恶性疟原虫氯喹抗性相关基因的多态性。方法 收集2001-2012年中国云南省西双版纳州景洪市、缅甸克钦邦拉咱市和掸邦第二特区勐冒县恶性疟病例滤纸血标本175份,采用巢式PCR法扩增恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter gene,pfcrt)基因第72-76位点片段和多药耐药基因1(Plasmodium falciparum multidrug resistance gene 1,pfmdr1)基因第86-1246位点片段,并对扩增产物测序分析。结果 共检测到pfcrt基因5种突变型(CVIEK,CVIDK,SVMNT,CVIET,CVIDT),该3个地区均以三重突变型(CVIET)为主,其中,中国云南西双版纳CVIET由2001年的76.7%上升至2006年的100%,缅甸拉咱市由2001年的75%上升至2007年的95%,但2012年又下降至77.5%,缅甸勐冒县2009年该突变型占比为67.5%。共检测到pfmdr1基因5种单突变型(N86Y,E130K,Y184F,S1034C,F1226Y)和2种双重突变型(N86Y/F1226Y,Y184F/F1226Y),其中2001年西双版纳pfmdr1基因野生型占36.7%,N86Y和Y184F突变率均为20%,F1226Y突变率为16.7%,而2006年以F1226Y突变为主占40%,且检测到二重突变型(N86Y/F1226Y和Y184F/F1226Y)占8%;缅甸拉咱市pfmdr1基因Y184F突变率从2001年的25%升高至2007年的35%和2012年的37.5%,该3年中野生型分别占65%、40%和55%;2009年缅甸勐冒县pfmdr1基因野生型比例为47.5%,Y184和N86Y单突变型分别为27.5%和25%。结论 中缅边境恶性疟原虫pfcrt基因均以三重突变型(CVIET)为主,氯喹抗性均较高,可为中缅边境地区恶性疟的防治提供参考。

恶性疟原虫抗药性基因研究现状

目前恶性疟原虫几乎对所有抗疟药物都产生了抗药性,研究与恶性疟原虫抗药性相关的恶性疟原虫氯喹抗药转运蛋白基因(Pfcrt)和恶性疟原虫多药抗药性基因(Pfmdr1)以及恶性疟原虫Kelch螺旋体蛋白基因(K13)突变有助于建立快速有效的疟原虫抗药性分子监测技术,对实现全球消除疟疾目标有着重要的意义。本文对恶性疟原虫药物抗性基因研究现状进行了综述。