恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48/45基因编码序列的体外扩增

目的：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs和Pfs48／45的基因序列，为进一步对其进行克隆和体外高效表达创造条件。方法：特定寡核苷酸引物的设计、合成与纯化；恶性疟原虫FCC1／HN株体外培养；利用碱裂解法从培养的恶性疟原虫FCC1／HN株提取染色体DNA；PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析。结果：从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中特异扩增出编码Pfs25和Pfs48／45基因序列，其片段大小分别为657bp和1，359bp。而用间日疟原虫基因组DNA为模板作对照，无扩增条带出现。结论：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48／45基因序列与预期长度相符合，从而，为该基因的克隆、测序和表达奠定基础。

Pfs25蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

目的:制备恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25的单克隆抗体(mAb),建立检测Pfs25蛋白的双抗体夹心ELISA方法。方法:纯化毕赤酵母表达的重组Pfs25蛋白,并免疫BALB/c小鼠,采用骨髓瘤细胞Sp2/0与免疫BALB/c鼠脾细胞杂交的细胞融合技术,通过间接ELISA检测获得分泌抗Pfs25抗体的阳性杂交瘤细胞株,通过免疫F1鼠诱生腹水,纯化腹水,并进行mAb的各项生物学鉴定。辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化后的抗体,以4B7为包被抗体,1B4为酶标抗体,建立了双抗体夹心ELISA法。结果:获得3株抗Pfs25的杂交瘤细胞株,其中2株有良好的稳定性和特异性。并建立了双抗体夹心ELISA检测法,检测有效范围在0.07～1 mg/mL,其检测灵敏度为41.6 ng/mL。结论:成功制备抗Pfs25蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于Pfs25蛋白检测的双抗体夹心ELISA法,为Pfs25蛋白制备传播阻断型疟疾疫苗奠定了基础。

恶性疟原虫膜蛋白Pfs25在毕赤酵母中的组成型表达

目的:Pfs25蛋白是传播阻断型恶性疟疾疫苗的侯选抗原,在毕赤酵母中表达Pfs25蛋白,并对表达产物进行鉴定。方法:参照GenBank中公布的pfs25基因序列,通过毕赤酵母喜好密码子分析人工合成目的基因;采取定向克隆策略构建重组表达质粒pfs25/pGAPZαA,经BstXⅠ线性化,电转染法转化酵母菌株GS115,在Zeocin抗性的筛选培养基上获得表达目的基因的pfs25/pGAPZαA/GS115重组酵母菌,SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物;通过在YPD培养基上传代培养和目的基因表达,验证重组菌株的遗传稳定性。结果:在毕赤酵母中表达了Pfs25蛋白,且重组菌株遗传性质稳定。结论:为研制基于Pfs25蛋白的传播阻断型恶性疟疾疫苗奠定了基础。

恶性疟原虫FCC-1/HN株pcDNA_3-Pfs25重组质粒在小鼠体内的免疫应答

目的 探讨恶性疟原虫ＤＮＡ 疫苗在小鼠体内的免疫反应。方法 将恶性疟原虫ＦＣＣ－ １／ＨＮ株有性期阶段的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ Ｐｆｓ２５ 经骨骼肌途径注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，对注射部位的骨骼肌进行了预处理，即于注射前７ｄ 先在左后肢股四头肌注射０．５％ 盐酸布比卡因５０μｌ，注射深度为２ｍ ｍ 。观察免疫后不同时间点小鼠血清ＩｇＧ抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、ＣＤ４＋ ／ＣＤ８＋ Ｔ细胞亚群比值和ＮＫ 细胞杀伤活性的变化。结果 １）重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ Ｐｆｓ２５ 经肌肉注射途径免疫小鼠后，机体ＩｇＧ抗体滴度增高、特异性Ｔ淋巴细胞增殖反应增强、ＣＤ８＋ Ｔ细胞亚群比值增高以及ＮＫ细胞杀伤活性增强。２）肌肉注射为一有效的ＤＮＡ疫苗免疫途径。结论 采用编码有性期基因的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ Ｐｆｓ２５ 经骨骼肌注射途径免疫小鼠，能诱导机体有效的体液免疫、细胞免疫和ＮＫ细胞杀伤活性。

不同的化学连接剂偶联恶性疟原虫Pfs25抗原和绿脓杆菌重组去毒外毒素rEPA

目的偶联恶性疟原虫Pfs25抗原和绿脓杆菌重组去毒外毒素rEPA,并测试不同化学连接剂的偶联效果。方法用化学连接剂NAHT(DL-N-acetylhomocysteine thiolactone)在Pfs25蛋白上加自由巯基,化学连接剂Sulfo-EMCS、EMCH、SBAP和Sulfo-SIAB分别修饰载体蛋白rEPA,通过巯基化的Pfs25和经化学基团修饰的rEPA在一定条件下反应,形成Pfs25与rEPA的偶联蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测偶联结果。结果成功地将Pfs25偶联到rEPA上,构建了偶联蛋白Pfs25-rEPA。对于蛋白的化学基团修饰,伯胺基与NHS(N-hydroxysuccinimide)酯之间的反应效率要高于以EDC为桥联剂的羧基与酰肼基之间的反应;对于偶联反应,马来酰亚胺基与巯基之间的反应效率要高于卤素乙酰基与巯基之间的反应。结论各化学连接剂都能将Pfs25偶联到rEPA上,但偶联效率各不相同,并形成不同样式的偶联蛋白。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离恶性疟原虫pfs25膜蛋白的免疫原性研究

目的:研究聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化的pfs25蛋白的免疫原性变化。方法:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分离了毕赤酵母表达的恶性疟原虫pfs25膜蛋白,按照常规程序将分离的pfs25膜蛋白免疫小鼠,以验证其免疫原性。通过荧光光谱分析、酶联免疫吸附实验,分析了聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中pfs25蛋白质免疫原性的变化情况。结果:SDS-PAGE方法成功分离了pfs25蛋白,免疫小鼠后不能产生特异性抗体;与pfs25标准品相比,纯化的pfs25蛋白的荧光光谱发生了改变,但是ELISA结果均为阳性。结论:聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化的pfs25蛋白保留了其免疫反应性,丧失了免疫原性。

恶性疟原虫云南株PFD-3/YN pfs25基因的测序及同源性分析

目的 了解恶性疟原虫云南株 PFD- 3/ YN pfs2 5基因序列变异情况。方法 PCR扩增恶性疟原虫云南株 PFD- 3/YN株 pfs2 5全基因 ,经 Sanger双脱氧链终止法测序和 Pst I酶切鉴定 ,并与国外恶性疟原虫 NF4株 pfs2 5进行比较。结果 恶性疟原虫云南株 PFD- 3/ YN株 pfs2 5基因与 NF4株的 pfs2 5基因其同源性为 99.2 %。结论 PFD- 3/ YN株与 NF4株 pfs2

微生物介导的疟原虫Pfs25和Pvs25疫苗研制现状

恶性疟原虫和间日疟原虫可分别引起恶性疟和间日疟。采用疫苗防治疟疾是当前研究的热点领域之一。Pfs25和Pvs25抗原是2种疟疾传播阻断期的疫苗候选分子,本文简要综述了根癌农杆菌、酵母菌、腺病毒、牛痘病毒和杆状病毒等微生物介导的疟原虫Pfs25和Pvs25疫苗的研制现状。

恶性疟原虫pfs25多拷贝基因在毕赤酵母中的表达分析

目的:对恶性疟原虫pfs25的多拷贝基因重组菌株在毕赤酵母中进行表达分析,研究基因拷贝数对Pfs25蛋白表达量的影响。方法:构建重组质粒pAO815-αpfs25,利用BglⅡ-BamHⅠ同尾酶的特点,将基因表达框AOX1-αpfs25-AOX1(TT)插入到单拷贝表达质粒,依次重复,构建多拷贝重组质粒pAO815-(αpfs25)n,线性化后电转化毕赤酵母GS115,用MD平板筛选并进行表达分析。结果:构建得到1、2、3、4、5、6、7、8、10、12和14个pfs25基因拷贝的重组菌株,8拷贝pfs25基因的重组菌株表达量最高。结论:成功得到了pfs25基因的多拷贝表达重组菌株,经分析,多拷贝pfs25基因的目的蛋白表达量与其拷贝数并不呈线性正相关。

恶性疟原虫Pfs25蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达策略的研究

目的:探索Pfs25蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达策略,提高Pfs25蛋白的表达量。方法:本研究主要通过4个方面深入研究Pfs25蛋白的高效表达策略。①构建Pfs25蛋白的诱导型表达重组株pPICZαA-Pfs25/GS115和组成型表达重组株pGAPZαA-Pfs25/GS115,并比较两酵母菌株的表达量差异。②从培养基、pH值、表达时间等方面入手,分别对诱导型和组成型分泌表达条件进行研究,寻找适合Pfs25蛋白表达的最佳条件。③利用pAO815表达载体构建Pfs25多拷贝重组酵母菌株pAO815-(α-Pfs25)n/GS115,通过提高pfs25基因拷贝数来提高表达量。④将毕赤酵母中蛋白二硫键异构酶(PDI)基因引入Pfs25重组酵母中,以提高Pfs25蛋白的分泌表达。结果:本研究成功构建了Pfs25诱导型和组成型表达重组酵母菌株,实现了Pfs25的诱导型和组成型表达,组成型表达量略高于诱导型。并通过对各种表达条件的比较研究,找到了适合Pfs25蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达的条件。结论:通过对Pfs25蛋白高效表达策略的研究,显著提高了Pfs25蛋白在毕赤酵母中的分泌表达水平,使其表达量提高了约5倍。

构建真核表达载体实现恶性疟原虫膜蛋白pfs25在CHO细胞中的重组表达

构建一种可实现外源基因高效的、适用于中华仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞的质粒表达系统,并成功实现了恶性疟原虫膜蛋白pfs25基因在CHO细胞中的表达。新构建的真核表达载体是在pBudCE4.1质粒载体上改造获得的,被命名为pCMV-WD,包含了人工合成的、完整的弱化SV40启动子与二氢叶酸还原酶(DHFR)基因组成的顺式表达元件和全新设计的多克隆位点,该载体属于CHO细胞通用载体,理论上可以实现任何外源基因在CHO细胞中的表达。基于该载体,采用定向克隆策略插入了恶性疟原虫膜蛋白pfs25基因,构建的重组表达质粒为pfs25/pCMV-WD。经zeocin抗生素和撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)双筛选,获得了DHFR+基因阳性的细胞克隆。对表达量最高的克隆株进行亚克隆,并经MTX加压筛选以获得高表达pfs25蛋白的CHO细胞株。ELISA和Western Blot结果表明,重组pfs25蛋白具有良好的免疫学反应性,且表达量为0.1 mg/mL。该研究首次获得了可分泌重组pfs25蛋白的CHO细胞株。

恶性疟原虫Pfs25基因在毕赤酵母中三拷贝串联分泌表达

目的:Pfs25蛋白是传播阻断型疟疾疫苗重要的候选抗原,然而,I期临床研究显示该蛋白在人体内只能激发较弱的免疫应答,如何提高Pfs25蛋白质的免疫原性成为研究重点。已有的研究表明:体外通过化学偶联方法获得的Pfs25蛋白聚合物,能显著提高其免疫原性。方法:本文从基因水平,利用同尾酶的特性构建串联的Pfs25基因三拷贝融合基因(Pfs25)3,每个单拷贝基因由连接臂(linker)连接,以保证每个单体Pfs25蛋白的活性不受影响。构建重组质粒(Pfs25)3/pPICZαA[或(Pfs25)3/pGAPZaA]电转毕赤酵母菌,获得酵母重组体。在三角瓶规模表达重组菌并初步纯化了目的蛋白(Pfs25)3。结果:ELISA和SDS-PAGE检测表达上清,显示有弱阳性表达。获得了纯度为83%的纯品蛋白。结论:在毕赤酵母中实现了Pfs25基因的三拷贝串联表达,为恶性疟疾疫苗的研发奠定了基础。

恶性疟原虫FCC-1/HN株不同期基因重组质粒混合接种小鼠后的免疫反应

寻找有效的抗恶性疟原虫混合基因疫苗 ,探讨其在宿主体内的免疫反应。将恶性疟原虫重组质粒 pc DNA 3-EBA175 / HRP 经骨骼肌途径单独注射或与有性期阶段的重组质粒 pc DNA3- Pfs2 5混合注射免疫 Balb/ c小鼠。对小鼠的骨骼肌进行预处理 ,即于注射前 7d在左后肢股四头肌注射 0 .5 %盐酸布比卡因 5 0μl,注射深度为 2 m m。观察免疫后不同时间点小鼠血清 Ig G抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、CD4+ / CD8+ T细胞亚群比率和 NK细胞杀伤活性的变化。结果显示 ,pc DNA3- EBA 175 / HRP 单独肌肉注射或与 pc DNA3- Pfs2 5混合肌肉注射免疫小鼠 ,均可见血清 Ig G抗体滴度增高、经恶性疟原虫抗原刺激后的特异性 T淋巴细胞增殖反应增强、CD4+ / CD8+ T细胞比率下降以及 NK细胞杀伤活性增强 ;加强免疫注射机体的免疫反应能增强。提示肌肉注射 DNA疫苗为一有效的免疫途径 ,采用编码恶性疟原虫两个基因的重组质粒单独免疫或与编码不同阶段基因的重组质粒混合免疫小鼠 ,均能诱导明显的体液免疫反应、细胞免疫和

恶性疟原虫合子/动合子表面25蛋白自身偶联条件的优化及其聚体蛋白的制备

目的探讨影响恶性疟原虫合子/动合子表面25蛋白(25 k Da Plasmodium falciparum sexual stage protein,Pfs25)偶联的因素,优化Pfs25蛋白的偶联反应条件,制备具有免疫原性的Pfs25纯化聚体蛋白。方法通过对偶联反应时Pfs25蛋白浓度、偶联反应的酸碱度、不同的缓冲液及偶联试剂添加方式的探索,考察不同反应条件对Pfs25蛋白偶联的影响。凝胶过滤层析纯化Pfs25偶联反应产物,双抗体夹心ELISA和SDS-PAGE对凝胶柱洗脱液进行检测,Western blot检测纯化的Pfs25聚体蛋白。结果 Pfs25蛋白偶联反应选择1/15 mol/L Na_2HPO_4-KH_2PO_4为偶联缓冲液,反应体系在pH 5.6～6.0时偶联效果更好,而Pfs25蛋白反应质量浓度为25 mg/m L时可获得最佳的Pfs25偶联效率(68.67%),凝胶过滤层析法获得Pfs25聚体蛋白,经双抗体夹心ELISA和Western blot检测,形成的Pfs25聚体蛋白保持了与Pfs25蛋白相同的抗体结合能力。结论优化了Pfs25蛋白最佳偶联反应条件,获得具有免疫原性的Pfs25纯化聚体蛋白。在形成Pfs25聚体中,以二聚体(Pfs25)2为主要形式,兼有少量三聚体(Pfs25)3和四聚体(Pfs25)4。

恶性疟原虫合子/动合子表面25蛋白ELISA定量检测方法的建立及其应用

目的建立恶性疟原虫合子/动合子表面25蛋白（25 KDa Plasmodium falciparum sexual stage protein,Pfs25）的ELISA定量检测方法。方法以双抗体夹心ELISA法为基础,建立Pfs25蛋白的ELISA定量检测方法,并对该方法进行重复性和准确性验证。用建立的方法检测不同重组菌株、CHO细胞中,以及经10 L发酵罐培养菌株纯化各阶段样品中Pfs25蛋白的表达量。结果建立的方法线性范围为0-1.6μg/ml,R2=0.984,检测灵敏度为0.032μg/ml,回收率为81%-119.0%,CV﹤15%。Pfs25-Pet42a/DE3表达后的Pfs25蛋白浓度在2.03-7.26μg/ml;Pfs25-p GAPZαA/GS115、Pfs25-p PICZαA/GS115和（α-Pfs25）8-p AO815/GS115表达后的Pfs25蛋白浓度分别为113、105和280μg/ml;3株Pfs25/CHO细胞表达的Pfs25蛋白浓度分别为106.11、116.89和155.01μg/ml。p PICZαAPfs25/GS115菌株发酵液中,Pfs25蛋白的增加呈先快后慢的趋势,72 h后,目的蛋白增加逐渐平缓;纯化洗脱液3个峰中Pfs25蛋白浓度分别为22.67、42.12和55.27μg/ml,流穿液中Pfs25蛋白浓度仅为0.096μg/ml。结论建立的Pfs25蛋白ELISA定量检测方法可用于疟疾疫苗研究中Pfs25蛋白的定量分析。