布鲁杆菌M16株pgm基因突变活菌苗株的构建和鉴定

目的 构建自杀性质粒载体,对布鲁杆菌M16株pgm基因进行精确突变,并对得到的pgm基因突变活菌苗株进行鉴定.方法 在puc19质粒载体上构建正向筛选标记--蔗糖敏感基因和反向筛选标记--卡那霉素抗性基因融合序列;用卡那霉素抗性基因融合序列对布鲁杆菌pgm基因进行修饰（插入突变）,完成pucS1.6K自杀性质粒载体的构建;通过电转化获得布鲁杆菌M16株pgm基因突变菌株;应用PCR方法对pgm基因突变菌株进行鉴定.结果 鉴定结果显示,布鲁杆菌M16株pgm基因在卡那霉素抗性基因插入后失活,突变后的布鲁杆菌M16株pgm基因DNA片段长度约为3525 bp,与预期的相符,布鲁杆菌M16株pgm基因突变菌株构建成功.结论 构建的自杀性质粒载体能成功对布鲁杆菌进行精确毒力基因突变,为获得布鲁杆菌突变株提供了一个有效的技术平台,也为新型减毒活疫苗的研制奠定了基础.

欧洲兔Pgm1基因的生物信息学分析

本研究利用生物信息学方法和工具对PGM1蛋白质的理化性质、结构功能域和功能分类进行了分析。结果表明:氨基酸残基的组成中甘氨酸含量最高,分子式为C2816H4392N738O837S17,相对分子质量62.5 ku,等电点为5.58。PGM1蛋白质具有一定的亲水性,可能为非跨膜蛋白,主要构件为α-螺旋和无规则卷曲,含有4个功能结构域,说明该蛋白质是生物体内糖代谢中重要的酶类。

布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因的原核表达与鉴定

对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶(pgm)蛋白进行了表达与纯化,为研究该基因的功能提供了物质基础。首先利用PCR方法从羊种布鲁氏菌基因组DNA中PCR法扩增pgm基因,并将该基因亚克隆至pET-28a(+)载体中,转化入大肠杆菌(DE3),诱导表达融合蛋白;表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:扩增了pgm的全基因,成功构建了布鲁氏菌pgm基因的原核表达载体pET-28a(+)-pgm,并且在大肠杆菌中进行了表达,经Western blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,且具有良好的免疫反应性。本研究为进一步研究布鲁氏菌pgm蛋白的生物学功能提供基础物质,也为进一步开发基因工程疫苗提供理论基础。

基于羊草种子转录组中PGM及SUS基因家族鉴定与分析

羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)是多年生优质饲草,具有适口性好、产量高、饲用价值高等特点。此外,由于羊草具有较强的抗性,因而能够改善土地贫瘠等劣势环境,是保护中国草地生态的重要建群种。为促进羊草种子萌发,探究萌发机理,本研究以无菌水处理羊草种子为对照,外源添加GA3为处理条件,基于前期转录组数据分析,确定了蔗糖和淀粉代谢通路中的PGM及SUS基因在种子萌发过程中有着显著作用。采用生物信息学的分析方法分别分析了两个基因家族的成员鉴定、保守结构域以及进化树,并结合FPKM值对PGM及SUS基因进行表达模式分析。结果表明:基于羊草种子转录组数据筛选出PGM及SUS基因家族的成员均为7个,PGM基因的分子量大小在15471.3~67912.9 Da,等电点数值大小在4.45~6.31,呈弱酸性。羊草种子中PGM家族均为亲水稳定蛋白。而SUS基因的分子量大小在30421.5~110262.9 kD,等电点除LcSUS1、LcSUS5、LcSUS7偏中性外,而其余的4个基因则偏弱酸性。LcSUS4、LcSUS6为稳定亲水蛋白,其余的为不稳定亲水蛋白。羊草种子中PGM及SUS基因家族在蔗糖和淀粉代谢通路中起到促进蔗糖和淀粉合成的基因酶作用。对羊草种子表达模式分析发现,GA3处理羊草种子PGM及SUS基因家族的基因通过不同表达量的正负调控蔗糖和淀粉通路来共同作用促进羊草种子萌发。