牙龈卟啉单胞菌菌毛相关外膜蛋白pgmA基因的克隆和表达

目的 :克隆牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonasgingivalis,Pg) pgm A基因 ,构建 pgm A基因表达载体 ,鉴定其表达产物的免疫性。方法 :采用高保真 PCR分别从牙龈卟啉菌 ATCC332 77和 4 7A- 1菌株中扩增 pgm A基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列 ,构建 p ET32 a的 pgm A表达载体 ,在 E.coli BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达 ,采用兔抗融合蛋白血清的 Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性 ,采用 ELISA检测 6 5株临床分离牙龈卟啉单胞菌与 Pgm A融合蛋白抗血清的反应情况。结果 :所克隆的牙龈卟啉单胞菌 ATCC332 77与 4 7A- 1菌株 pgm A基因的核苷酸序列同源性为 10 0 %,与报道的相应核苷酸序列同源性为 98.98%,氨基酸序列同源性高达99.18%。p ET32 a- pgm A- BL2 1DE3系统的 Pgm A融合蛋白表达量为细菌总蛋白的 5 0 %左右。Pgm A融合蛋白免疫家兔能获得相应抗体并与 Pgm A蛋白发生结合反应。 ELISA结果证实 92 .3%的牙龈卟啉菌临床菌株 (6 0 / 6 5 )能与Pgm A融合蛋白抗血清发生结合反应。结论 :本研究成功地构建了 Pg pgm A高效表达系统 ,所表达的 Pgm A融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性 ,可作为 Pg检测试剂盒和 Pg疫苗的候选抗原。

海豚链球菌simA和pgmA真核表达质粒对尼罗罗非鱼免疫保护的研究

尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是世界水产养殖业中的重要经济鱼类,但在养殖生产中易受海豚链球菌(Streptococcus iniae)感染而致病致死,使用疫苗是一种相对理想的防感染措施。该研究采用海豚链球菌simA、pgmA基因构建的真核表达载体作为DNA疫苗,肌肉注射罗非鱼评估疫苗保护效果。免疫后在DNA和RNA水平上,在注射鱼体内检测到2个目的基因。首次免疫后第7至第28天,鳃、肝、肾脏、头肾中疫苗组的白介素1 (Interleukin,IL-1β)与肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)表达量高于PBS对照组;疫苗组的抗体滴度、血清抗菌活性显著(P<0.05)高于PBS对照组。攻毒后,注射pcDNA3.1-pgmA、pcDNA3.1-simA、pcDNA3.1-pgmA与pcDNA3.1-simA等比例混合疫苗的相对保护率(Relative percent survival,RPS)分别为60.7%、49.9%和75.0%。结果表明所制备的疫苗具有免疫保护效果,可作为候选疫苗。

慢性牙周炎龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白A的水平与牙周病变程度关系的研究

目的检测慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)患者龈下菌斑标本中牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白A(porphyromonas gingivalis outer membrane protein A,PgmA),了解PgmA水平与牙周病变程度的关系。方法采用SDS-PAGE检测原核表达系统重组PgmA(rPgmA)表达和Ni-NTA亲和层析法提取的rPgmA纯度,rPgmA免疫家兔获得抗血清,建立ELISA检测56例CP患者209个龈下菌斑标本中的PgmA,并分析PgmA水平与牙周病变程度的关系。结果rPgmA表达产量约为细菌总蛋白的50%。提纯的rPgmA SDS-PAGE后仅见单一的蛋白条带。90.0%的龈下菌斑标本(188/209)PgmAELISA阳性。重度CP龈下菌斑标本中PgmA含量明显高于轻度CP标本(P<0.05),但轻度和中度、中度和重度CP标本之间PgmA含量差异无统计学意义(P>0.05)。结论慢性牙周炎病变程度与龈下PgmA水平有关,PgmA可能是Pg毒力因子之一。