phCMV1和pcDNA3表达人绒毛膜促性腺激素β-C3d3融合蛋白的表达效率比较

目的 比较真核表达载体 phCMV1和pcDNA3在中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞中表达人绒毛膜促性腺激素 β(hCGβ) C3d3融合蛋白的表达效率 ,以获得hCGβ C3d3融合蛋白的高效表达。 方法 利用高效真核表达载体 phCMV1,构建带有 6个组氨酸纯化标签的融合蛋白表达质粒phCMV1 6His hCGβ C3d3;脂质体法介导phCMV1 6His hCGβ C3d3和pcDNA3 hCGβ C3d3转染CHO细胞 ,G4 18(80 0 μg/ml)筛选抗性克隆 ,G4 18(30 0 μg/ml)维持培养、扩增 ,待阳性克隆 95 % 汇片时换用无血清培养基培养。放射免疫法检测hCGβ表达量 ,Westernblot鉴定表达产物 ,Raji细胞免疫化学染色法鉴定hCGβ与C3d分子的成功融合。反复冻存和复苏高效表达hCGβ C3d3融合蛋白的阳性克隆 ,比较表达效率的变化。用镍柱和凝胶过滤层析纯化表达产物。 结果 酶切鉴定及测序证实 phCMV1 6His hCGβ C3d3构建正确 ,并成功地在CHO细胞中获得了 6His hCGβ C3d3融合蛋白的表达。无血清培液中 2 4、4 8、72h融合蛋白的表达量分别为 4 96、5 2 7、6 33mIU/ml/ 1× 10 6细胞 (以hCGβ含量计算 ) ,phCMV1比 pcDNA3载体的表达效率高 1.4倍。 3次冻存和复苏高效表达hCGβ C3d3融合蛋白的阳性克隆 ,表达效率无明显变化。表达产物经纯化后获得了所需的hCGβ C3d3?

hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白在CHO细胞中的分泌性表达、鉴定与纯化

目的 :构建带有 6个组氨酸纯化标签的hCGβ和hCGβ C3d3融合蛋白的分泌型真核表达质粒 ,在CHO细胞中获得具有生物学活性的重组蛋白的高效表达。方法 :利用高效真核表达载体phCMV1,构建phCMV1 6His hCGβ和phCMV1 6His hCGβ C3d3,脂质体法转染CHO细胞 ,G4 18(80 0 μg ml)筛选抗性克隆。放射免疫法检测抗性克隆培液中hCGβ表达量 ,Westernblotting和Raji细胞免疫化学法鉴定hCGβ C3d3融合蛋白。用镍柱和凝胶过滤层析纯化表达产物。 结果 :酶切及测序结果显示 ,phCMV1 6His hCGβ及phCMV1 6His hCGβ C3d3构建正确。在CHO细胞中成功地获得了hCGβ和hCGβ C3d3融合蛋白的高效表达 ,phCMV1载体的表达效率是pcDNA3的 1 6倍。表达产物经纯化后得到了所需的hCGβ和hCGβ C3d3融合蛋白。 结论 :hCGβ和hCGβ C3d3融合蛋白在CHO细胞的高效表达为下一步比较hCGβ抗原及hCGβ