phaC1、phaC2基因双价植物表达载体的构建及其转基因烟草的获得

利用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从类产碱假单胞菌YS1(PseudomonaspsuedoalcaligeneseYS1)染色体DNA中扩增并克隆了调控短链与中链PHA生物合成的两个关键酶基因 :phaC1、phaC2基因。同时利用套叠PCR技术对 phaC1基因进行了改造 ,经过基因拼接构建了植物表达载体pC3C1(嵌合phaC1)、pC3C2 (嵌合 phaC2 )和 pC3C1C2 (嵌合 phaC1和 phaC2双基因 )。将构建好的嵌合 phaC1和phaC2双基因的植物高效表达载体 pC3C1C2 ,用冻融法转入根癌土壤杆菌 (AgrobacteriumtumefaciensEHA10 5 )并且通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草 (NicotianatobacumHonghuadajinyuan)。 2个月后获得了一批卡那霉素抗性烟草植株 ,抗性植株大田生长表型正常 ,生长速度相对缓慢。抗性植株经过PCR、PCR Southern、Southern检测初步确定有 32 %烟草稳定整合了 phaC1和 phaC2。用氯仿 -次氯酸钠直接从部分Southern检测阳性转化植株中抽提纯化得到PHA ,在产物合成水平确证有 2 5 6