肠侵袭性大肠埃希菌噬菌体DK-13的生物学特性及应用

【目的】筛选并分离出能裂解肠侵袭性大肠埃希菌噬菌体,分析其生物学特性,并探究其对污染猪肉的杀菌作用。【方法】采用双层平板法分离鉴定噬菌体,并测定其最佳感染复数,一步生长曲线等,对其基因组进行测序分析以及裂解功效的测定。【结果】从医院污水中分离鉴定能特异裂解肠侵袭性大肠埃希菌(Enteroinvasive Escherichia coli,EIEC)的噬菌体并命名为DK-13,其呈典型的蝌蚪状外形,包含一个正二十面体的头部和一个可收缩的螺旋对称的尾部,属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)噬菌体;生物学特性表明:最佳感染复数为0.01,潜伏期约为10 min,裂解期约为70 min,噬菌体DK-13能在50℃,pH 5.0-10.0条件下存活。全基因组测序表明,噬菌体基因组长约172 275 bp,GC含量为40.18%,预测其共有293个开放阅读框(open reading frames,ORF),未发现已知耐药基因和毒力基因。应用试验表明:被污染的猪肉中表现的杀菌效果良好,宿主菌的数量明显减少。【结论】分离并鉴定一株新的烈性噬菌体DK-13,DK-13具有潜伏期短、裂解效率高等优势,在食品安全方面具有很大应用潜力。

噬菌体抗细菌生物膜机制及应用策略的研究进展

细菌生物膜(bacterial biofilms,BF)是细菌在生物或非生物表面所形成的复杂微生物群落,其形成显著增强了细菌毒力和耐药性,与高比例的慢性细菌感染相关,对人类健康造成严重威胁。传统抗生素和常用消毒剂在清除生物膜方面的能力有限,迫切需要一种有效的新策略治疗细菌生物膜。噬菌体(bacteriophage,phage)作为一类能感染并裂解细菌的病毒,具有较高的安全性和特异度,被认为是治疗细菌生物膜有前景的替代方法。该文综述了噬菌体抗细菌生物膜的作用机制、基于噬菌体及其衍生物在防控细菌生物膜形成的应用策略,为开发高效的噬菌体抗细菌生物膜方法提供新思路。

抗噬菌体发酵剂在乳品工业中的应用及对发酵过程的控制

近年来,随着乳品消费需求的持续增长和生产工艺的不断升级,乳品工业面临着日益严峻的微生物安全问题,其中噬菌体污染对乳品发酵过程的影响尤为突出。噬菌体是侵染乳酸菌的病毒,其广泛分布与快速增殖特性严重威胁着乳品发酵的稳定性与产品质量,影响着乳品企业的经济效益和市场声誉。噬菌体污染已成为制约乳品发酵稳定性和产品质量的关键因素。抗噬菌体发酵剂的研发与应用,结合严格的工艺控制措施,为应对这一挑战提供了有效的解决方案,以确保乳品发酵的顺利进行和产品质量的提升。本文探讨抗噬菌体发酵剂在乳品工业中的重要作用及其对发酵过程的控制策略。

噬菌体疗法在动物细菌感染中的应用研究进展

近年来,随着畜禽养殖业的飞快发展,畜禽养殖过程中抗生素的不合理使用情况越发频繁,细菌耐药性问题也越发严重,“禁抗、减抗、限抗”已成畜牧业发展的必然趋势。因噬菌体治疗动物细菌性疾病具有专一性强、不易产生抗性等优点,噬菌体已经作为抗生素替代品应用于动物疾病治疗领域。笔者对噬菌体疗法的主要应用方式和其在家禽、猪、犬、猫和牛细菌性传染病中的应用研究进行总结,以期为噬菌体在动物疫病防控方面的应用提供理论参考。

噬菌体和枯草芽孢杆菌联用对蛋鸡生产性能、蛋品质、卵巢及输卵管的影响

试验旨在研究产气荚膜梭菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体及枯草芽孢杆菌联用对蛋鸡生产性能、蛋品质、卵巢及输卵管的影响。试验选取126只260日龄海兰褐蛋鸡,随机分成6组,每组3个重复,每个重复7只。对照组饮用清水,SD72噬菌体组、SD72噬菌体+枯草芽孢杆菌组、JDF1-6噬菌体组、SD72/JDF1-6噬菌体+枯草芽孢杆菌组和SD72噬菌体+抗生素组(0.0075%金霉素、0.0004%杆菌肽),分别在不同饮水器中按体积比为1∶100在饮水中添加1010PFU/mL噬菌体原液、1010PFU/mL枯草芽孢杆菌及抗生素,试验期42d,记录采食量、平均日增重、产蛋量,分析蛋品质、卵巢及输卵管组织变化。结果显示:与对照组相比,饮水1~42d后SD72噬菌体组、SD72噬菌体+枯草芽孢杆菌组、SD72/JDF1-6噬菌体+枯草芽孢杆菌组蛋鸡产蛋率显著提高(P<0.05),料蛋比显著降低(P<0.05);饮水29~42 d后,SD72噬菌体组、SD72噬菌体+枯草芽孢杆菌组、SD72/JDF1-6噬菌体+枯草芽孢杆菌组蛋壳重、哈氏单位显著提高(P<0.05);42d饲喂周期中各组蛋鸡的卵巢和输卵管形态均无异常,卵泡发育正常,未见减少和闭锁,输卵管膨大部无炎性反应。结果表明,产气荚膜梭菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体和枯草芽孢杆菌联用42d能提高蛋鸡生产性能、蛋品质,对卵巢和输卵管发育无副作用。

控制细菌生物膜感染的可替代策略-噬菌体疗法

在自然界中,细菌常以细菌生物膜的形式存在,其形成给公共卫生、食品安全、环境等诸多领域带来了不利影响。复杂的细菌生物膜结构为生理多样化的细菌细胞提供了保护屏障,细菌生物膜的形成是细菌感染及细菌抗药耐药性问题出现的主要驱动因素。噬菌体是细菌的天敌,细菌与噬菌体之间的共同进化迫使噬菌体开发特定的策略来克服生物膜防御屏障并杀死细菌。本文总结了细菌生物膜的组成、结构、形成过程及噬菌体对细菌生物膜的感染机制;综述了基于噬菌体及其衍生物对抗生物膜和耐药细菌感染的最新研究进展;最后,针对目前噬菌体疗法存在的问题进行了讨论,以期发现和更好地利用噬菌体的天然抗菌潜力,促进新型、高效的细菌生物膜检测及控制技术进一步发展。

泛耐药铜绿假单胞菌菌株广谱噬菌体裂解酶的获取及抗菌活性观察

目的获取泛耐药铜绿假单胞菌(PA)广谱噬菌体裂解酶,并观察其抗菌活性。方法(1)取237株PA菌株,采用药敏实验筛选得到84株泛耐药PA菌株。采用噬菌斑测定法,将污水与10株泛耐药PA菌株混合培养,筛选得到9株泛耐药PA菌株噬菌体,并用84株泛耐药PA菌株,筛选出90%以上泛耐药PA菌株的广谱噬菌体。(2)采用Proteinase K裂解法及测序获取泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶基因、运用生物信息学工具(ORF finder和BLAST)进行序列确认,获得泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶的基因序列(目标序列),将目标序列克隆、转化、诱导纯化后得到泛耐药PA广谱噬菌体裂解酶。取泛耐药PA菌株,将其均匀涂抹至2个培养基,分别滴加5、10μL泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶,培养24 h时观察培养基噬菌斑生长情况。结果得到泛耐药PA菌株广谱噬菌体EPA19及EPA19裂解酶lysEPA19。5、10μL的lysEPA19与泛耐药PA菌株混合培养后,培养基上均可见噬菌斑(5μL LysEPA19噬菌斑为11~13mm,10μL LysEPA19噬菌斑为23~27 mm)。结论成功筛选得到泛耐药PA广谱噬菌体裂解酶lysEPA19,可有效抑制泛耐药PA菌株生长。

1株类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体的生物学特性和杀菌能力评估

为探究类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体的生物学特性,本试验采用双层平板法分离筛选类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体;采用形态学、一步生长曲线、宿主范围测定分析该噬菌体的生物学特性;通过小鼠体内杀菌试验和体外消毒能力检测评估该噬菌体的疗效。结果显示,成功分离出1株类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体,命名为HNS1。形态学观察显示,噬菌体头部为正二十面体,直径为(62.8±3.0)nm,尾部长为(54.9±5.0)nm,根据命名法则该噬菌体属于肌尾噬菌体。一步生长曲线测定结果显示,该噬菌体的潜伏期约为32 min,释放量约为8.04 PFU/infection center。宿主范围测定结果显示,该噬菌体的裂解率达到73.3%(11/15)。小鼠体内杀菌试验和体外消毒能力检测结果显示,该噬菌体能够有效在小鼠体内和环境中裂解类鼻疽伯克霍尔德菌。结果表明,筛选得到的噬菌体具有较广的裂解谱,可能成为治疗类鼻疽伯克霍尔德菌感染的潜在抗菌剂。

非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性纳米抗体的筛选与鉴定

【目的】利用噬菌体展示技术筛选非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)K205R蛋白的特异性纳米抗体。【方法】将原核表达、纯化的ASFV K205R蛋白免疫双峰驼,采集全血,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA并反转录,巢式PCR扩增VHH基因,构建VHH噬菌体文库,利用噬菌体展示技术筛选K205R特异性纳米抗体。【结果】成功构建库容量为5×10^(8)的VHH噬菌体文库,然后利用噬菌体展示技术经过3轮淘选,特异性VHH噬菌体得到明显富集,氨基酸序列比对显示共筛选出5株K205R蛋白的特异性纳米抗体,分别为ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb14、ASFV-K205R-Nb35、ASFV-K205R-Nb64和ASFV-K205R-Nb82。【结论】筛选的5株纳米抗体均具有良好的特异性,其中ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb35和ASFV-K205R-Nb82具有更好的亲和力,为以纳米抗体作为灵敏探针建立的特异性强、灵敏度高、成本低的新型ASFV血清学诊断方法提供依据。

工程噬菌体的合成生物学“智造”

噬菌体,以杀菌特性而闻名的天然病毒,是地球上多样性和丰度最高的生物体。在过去100多年中,噬菌体的研究极大地推动了遗传学、分子生物学和合成生物学的发展。随着耐药超级细菌的流行,噬菌体疗法引人入胜的科学历史也被广为传颂。然而,相对于自然环境中丰富的噬菌体数量(总数为10^(31),比所有其他生物的总和还要多),目前只有少数噬菌体成功应用于对抗耐药性细菌感染及其他工程领域。当前,急需践行合成生物学从“造物致知”到“造物致用”理念,采用高通量测序和基因组精准编辑等先进生物技术来创建具有独特属性的增强变体,提高噬菌体治疗的疗效和可编程性。本文综述了近年来噬菌体基因工程改造方法的技术进展以及合成生物学助力噬菌体应用技术发展的研究动态,如按照实际需求改造噬菌体宿主范围、借助宏基因组挖掘自然界中噬菌体的广泛资源、结合多组学技术揭示噬菌体与宿主互作的分子机制、调控肠道噬菌体组维持肠道稳态以促进人体健康及利用大数据和新型人工智能指导噬菌体理性设计。总之,合成生物学正在跨时代驱动传统实验研究范式转变,结合“设计—构建—测试—学习(DBTL)循环”理性设计目标噬菌体,无论是自上而下的体系优化,还是自下而上的生命体重构,工程噬菌体的合成生物学“智造”都大有可为。

噬菌体疗法在胞内病原菌治疗中的挑战与思考

胞内病原菌是一类可以侵入并在哺乳动物细胞内生存的病原菌,它们可以调节宿主细胞内环境以便自身繁衍扩散。由于细胞膜等结构的保护,胞内病原菌在细胞内不容易被药物接触到,且容易积累耐药性,使得胞内病原菌的治疗成为一个悬而未决的难题,亟需新的治疗方法。噬菌体疗法是利用噬菌体裂解细菌治疗病原菌感染的手段。由于其不会对动物细胞产生危害,已经被广泛用于治疗病原细菌的胞外感染,同时为胞内病原菌的治疗提供了行之有效的新思路。本文介绍了细胞内病原体侵入和定居在真核细胞中的策略,以及它们对抗生素的抗性机制。噬菌体疗法具有独特的杀菌机制及突出的优势,因此噬菌体疗法在处理细胞内病原体特别是耐药病原体方面有巨大潜力。但噬菌体疗法在治疗细胞内病原体方面的应用仍面临许多挑战,如噬菌体不能轻易穿过真核细胞膜与细胞内病原体接触。最后,讨论了噬菌体疗法在治疗细胞内耐药病原体方面可能的发展方向。未来需解决噬菌体入胞难题,通过细胞穿透肽修饰或纳米材料修饰,使噬菌体能够有效地进入真核细胞。在此基础上,可以对噬菌体本身进行改造,获得杀菌效果更强的重组噬菌体,并进一步挖掘包括温和噬菌体在内的噬菌体资源。

一株肠道分离的噬菌体对临床金黄色葡萄球菌裂解作用的评价

目的:评估肠道分离的一株噬菌体在治疗临床金黄色葡萄球菌感染中的价值。方法:采用液体培养和双琼脂法从病人粪便样本中分离纯化噬菌体。用宏斑法测试60株临床金黄色葡萄球菌对该噬菌体的体外敏感性,并对其行抗生素耐药性分析。此外,进行金黄色葡萄球菌感染大蜡螟模型体内实验,以评估该噬菌体用于治疗金黄色葡萄球菌感染的效果。结果:成功从病人粪便中分离一株可裂解金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300的噬菌体SY01。宿主范围分析显示有66.7%临床分离的金黄色葡萄球菌对其敏感,且与细菌耐药性无明显相关性。大冥蜡虫模型研究中,所分离的噬菌体治疗金黄色葡萄球菌感染幼虫7d生存率较对照组升高。结论:本实验分离的肠道噬菌体SY01具有治疗包括MRSA和MSSA在内的金黄色葡萄球菌的潜在价值。

抗噬菌体菌株荧光假单胞菌A46在D-异抗坏血酸钠工业生产中的应用研究

荧光假单胞菌A4 6是通过紫外线诱变K10 0 5菌株所得到的一株抗噬菌体菌株。在噬菌体存在的情况下 ,使用菌株A4 6和K10 0 5在 50kL的发酵罐上进行了 2 酮基 D 葡萄糖酸的发酵生产。结果表明 ,荧光假单胞菌A4 6对噬菌体的抗性稳定 ,其发酵周期短 ,发酵转化率高 ;经过多次传代 ,荧光假单胞菌A4 6对噬菌体的抗性及其发酵生产 2 酮基 D 葡萄糖酸的能力没有改变 ;该菌株的发酵产物可以用于D

噬菌体展示技术系统发展进展

噬菌体展示技术(Phage display technology,PDT)是一种特殊的基因工程重组表达技术,噬菌体展示技术系统(Phage display system,PDS)是指包括经过遗传改造后的系列噬菌体、辅助噬菌体、宿主细菌等集成平台(含试剂盒)。文章从噬菌体分子遗传学及其基因(基因组)遗传工程改良角度,基于噬菌体M13、λ、T4和T7等4大类典型噬菌体展示技术系统的发展进展进行了综述。重点强调不同展示系统中的核心部件及其基因工程改造的分子遗传学原理、不同展示锚定位点的技术特征、相关试剂盒的研制状况及选择依据。

噬菌体展示外源多肽的免疫原性研究

利用噬菌体展示技术将丝状噬菌体fd基因 8克隆入 pKK2 2 3-3质粒中 .将白色念珠菌特异表位基因插入到修饰后的质粒载体中 ,并制备了杂合噬菌体 .利用纯化的该表位抗原PA免疫小鼠 ,结果表明该噬菌体 -表位抗原PA在有无佐剂存在的情况下均产生抗体 ,用ELISA方法采用双波长 (4 50 / 6 30nm)检测抗体 ,其在有无佐剂存在的情况下光密度值无明显差别 .免疫后小鼠脾淋巴细胞在有无佐剂的情况下均产生明显增殖 ,未见明显的毒副作用 ,具有良好的安全性 .该方法产生的抗体与传统的合成多肽相比具有方法简便、低价高效等特点 .它将成为生产高效低价疫苗的有效途径 .该噬菌体 -表位抗原PA为真菌疫苗的研制打下基础 .

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌A46抗噬菌体菌株的选育

从2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)A46的异常发酵液中分离到1种噬菌体,将其命名为KS461。透射电镜观察表明,KS461呈近球形,直径为52nm。以荧光假单胞菌A46为出发菌株,利用紫外诱变的方法,获得了4株对噬菌体KS461具有抗性的2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株,并研究了这些变异株的遗传稳定性。研究结果表明,经8次传代,这些变异株对噬菌体的抗性及其发酵产酸能力没有改变。

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌K1005抗噬菌体菌株的选育

从 2 -酮基 -D -葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌K1 0 0 5的异常发酵液中分离到两种噬菌体 ,分别将其命名为KS5 0 2和KS5 0 3。电镜观察表明KS5 0 2呈微球形 ,直径为 61nm ;KS5 0 3呈蝌蚪形 ,具有直径为 68nm的六角形头部及 85nm长的尾部。利用紫外线诱变的方法 ,经多次分离筛选 ,获得了 2株抗性稳定且产酸水平超过对照敏感菌的抗噬菌体菌株 。

噬菌体展示肿瘤异性抗原表位的初步免疫活性研究

利用噬菌体展示技术将丝噬菌体(fd)基因8克隆入pKK233-3质粒中,将人的恶性黑色素瘤的抗原表位基因插入到修饰后的质粒载体中,制备了含有抗原表位的杂合噬菌体.利用纯化的表位抗原免疫小鼠,用间接ELISA方法采用双波长(450/630nm)动态检测抗体.结果表明,噬菌体-表位抗原刺激小鼠产生了抗体.抗体的含量随时间不断增加,到4周时达到高峰.小鼠脾淋巴细胞转化实验表明噬菌体-表位抗原产生了明显的淋巴细胞增殖反应,为研制肿瘤疫苗奠定了基础.

噬菌体对三大耐药菌的防控作用研究进展

噬菌体发现之初,便被前苏联和东欧医学界用来治疗细菌感染。但是,随着抗生素时代的到来,人们慢慢忽略了对噬菌体的深入研究。近年来,由于全球耐药菌感染率不断攀升,用抗生素治疗细菌感染面临前所未有的挑战,一系列耐药病原菌的出现,如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis),尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)的出现,使得一些科学家和临床工作者开始把注意力重新集中到噬菌体研究上来,并在这个领域取得了较大进展。大量的实验证明:噬菌体可以有效地提高细菌感染的实验动物的存活率。本文就近几年国内外科研工作者在噬菌体治疗金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌三大耐药菌领域所取得的进展做一综述。

荧光假单胞菌AR4在2-酮基-D-葡萄糖酸工业生产中的应用研究

在噬菌体存在的情况下,采用抗噬菌体菌株荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)AR4在200m3发酵罐上进行了2-酮基-D-葡萄糖酸的发酵生产。结果表明,荧光假单胞菌AR4对生产环境中噬菌体的抗性稳定,发酵周期短,发酵转化率高;经过10次传代,荧光假单胞菌AR4对噬菌体的抗性及其发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的能力没有改变;该菌株的发酵产物可以用于食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠的合成。