Phalloidin对钙离子载体A23187诱导的人精子顶体反应的作用

目的:探讨F-肌动蛋白在人精子顶体反应(AR)过程中的重要作用及可能机制。方法:将每例标本分为A、B、C、D、E 5组,共30例。以链球菌溶血素O(SLO)、Phalloid in、钙离子载体A23187分别处理各实验组人精子,其中A:A23187 3μmol/L;B:Phalloid in 40μmol/L+A23187 3μmol/L;C:SLO 0.5 U/m l+A23187 3μmol/L;D:SLO0.5 U/m l+Phalloid in 40μmol/L+A23187 3μmol/L;E:不添加任何试剂。分别采用罗丹明标记山豌豆凝集素(Rhodam ine-PSA,10μg/m l)荧光染色检测其AR,计算各组AR发生率(AR%)。结果:在5个实验组中,除A组与B组比较差异无显著性(P>0.05)外,其余各组两两比较差异均具有显著的统计学意义(P<0.01)。结论:Phalloid in对质膜完整的人精子AR发生率无影响。而在添加SLO的人精子模型中,Phalloid in较对照组能显著降低人精子AR发生率,提示F-肌动蛋白的聚合作用对人精子AR的发生具有重要意义,并且主要发生在精子顶体的内部。

化妆品眼刺激性评价中角膜损伤生物标志物研究

针对离体兔眼(IRE)试验只适用于筛选严重眼刺激性(UN GHS第1类)的缺陷,建立IRE试验结合基于细胞活性生物标记物的荧光染色方法用于评价化妆品眼刺激性。通过IRE试验条件的探索,包括测试浓度和后暴露时间,对市售化妆品进行眼刺激性检测,同时对角膜进行冰冻切片并染色,鬼笔环肽对丝状肌动蛋白进行染色,DAPI染色胞核后,测量损伤深度(depth of injury,DOI),并比较体外DOI、体内DOI及Draize试验结果,建立预测模型。结果显示通过DOI检测,可对化妆品无刺激性至中刺激性进行检测,表明在离体兔眼中,基于细胞活力的DOI测量可作为角膜损伤的生物标志物,适用于化妆品眼刺激性的评价。

超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定毒蘑菇中5种鹅膏肽类毒素

鹅膏肽类毒素是毒蘑菇中毒事件中最常见的致死毒素,因此研究建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测毒蘑菇中5种鹅膏肽类毒素的方法。样品经纯水提取后,以乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)为流动相进行梯度洗脱,用HSS T3色谱柱(100 mm×2.0 mm, 2.1μm)对待测组分进行色谱分离;采用可加热电喷雾电离源(HESI),全扫描/数据依赖二级质谱扫描(Full mass-ddMS^(2))模式对待测物进行定性分析;在目标离子选择性扫描(Targeted-SIM)模式下,以外标法对待测物进行定量测定。结果显示,5种鹅膏肽类毒素在1.0~20.0μg/L范围内均呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.99,检出限均为0.006 mg/kg,加标回收率为81.8%~102.4%,相对标准偏差为3.2%~8.3%。方法提供了丰富的化合物特征信息,可根据提取离子流色谱图结合同位素分布信息锁定可疑化合物,根据一级质谱和二级质谱碎片离子的精确质荷比,在没有相关标准品的情况下可对未知化合物进行结构推断和确证。方法样品前处理简单,定性分析特异性强,定量测定灵敏度高,可满足突发公共卫生事件快速定性定量的检测要求,同时也为开展此类毒素中毒快速筛查及未知毒素的结构锁定提供了可靠的技术支撑。

基于细胞骨架差异的心肌细胞纯度快速鉴定方法

目的寻找并确定一种优于传统且简单快速的心肌细胞鉴定方法。方法取1~3d龄SD大鼠心脏,0.1%Ⅱ型胶原酶消化,差速贴壁分离心肌细胞与心肌成纤维细胞,对心肌细胞使用5-溴脱氧尿嘧啶进行纯化,并通过传代对心肌成纤维细胞进行纯化。采用免疫荧光法,Phalloidin固定染色和Tubulin Tracker活细胞染色鉴定心肌细胞与心肌成纤维细胞。结果心肌细胞的微丝与微管可分别被Phalloidin和Tubulin Tracker标记,而心肌成纤维细胞的微丝和微管均未被标记,且这两种染色方法耗时极少。结论基于细胞骨架差异的特征,通过标记微丝或者微管能够简便快速鉴别心肌细胞和心肌成纤维细胞。本方法明显优于免疫荧光染色,将提高心血管疾病在细胞水平上的研究效率。

鹅膏菌毒素的研究进展

鹅膏菌的主要毒素根据其结构、性质等可分为鹅膏毒肽、鬼笔毒肽和毒伞素3类。通过对毒肽进行定向修饰,可以改造它们的化学性质和生物学特性。随着对它们的深入了解和研究,这3类毒肽已经成为具有广阔研究和应用前景的新兴资源。为进一步认识和利用这些资源,本文对鹅膏菌毒素的分布、检测、化学结构、化学性质、代谢动力学、毒理,临床症状与治疗,以及综合利用等方面的研究进展作了系统的总结和评述。

超高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间串联质谱指纹图谱检测毒蕈中4种鹅膏肽类毒素

建立了基于超高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间串联质谱技术(UPLC-ESI-Q-TOF)的4种鹅膏肽类毒素特征信息的色谱和质谱指纹图谱和分析鉴定方法。样品用含0.1%TFA的甲醇溶液提取后,再用Oasis HLB固相柱净化,洗脱液经UPLC HSS T3色谱柱分离后,采用ESI-TOF MS和ESI-Q-TOF MS2进行测定;建立了包含毒素准分子离子准确质量数及其同位素特征,以及二级质谱特征子离子信息的指纹图谱;方法定量测定的线性范围在50～1000μg/L,相关系数在0.9974～0.9985之间;4种毒素的检出限均为10μg/L;定量限为50μg/L;加标回收率在68.2%～88.2%之间;相对标准偏差为7.2%～11.8%。对采集的20余种野生菌样品进行分析,有5种样品检测出含有毒素。本方法快速、准确、选择性好、特异性强,适用于突发毒蕈中毒事件样品中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽的确证分析。

长白山鹅膏菌肽类毒素的HPLC分析

采用HPLC法对长白山地区分布的10种鹅膏菌中的-鹅膏毒肽(-amanitin)、鹅膏毒肽(-amanitin)和鬼笔毒肽(phalloidin)3种毒素的含量进行了测定。结果表明:白鹅膏(A.verna)和鳞柄白鹅膏(A.virsa)中含有-amanitin和-amanitin两种毒素,二者-amanitin的含量分别为 1861.85g/g和2477.02g/g,均高于欧洲产毒鹅膏(A.phalloides)中的含量(1607g/g)而接近灰花纹鹅膏Amanita fuliginea中的量(2633.80g/g)。毒鹅膏A.phalloides中含有3种毒素,并且菌蕾中的含量高于成熟子实体,尤其菌蕾中Phalloidin的含量(1113.35g/g)是灰花纹鹅膏成熟子实体中(432.5g/g)的3倍。

鹅膏菌毒素及其毒理研究进展

鹅膏菌是一类真菌的总称 ,误食野生蘑菇的中毒事件中 ,95%以上由鹅膏菌引起。国外自六十年代起 ,对其毒素毒理进行了深入的研究 ,而国内则只是在九十年代才刚开始这方面的工作。为促进国内鹅膏菌毒素毒理的研究 ,作者概括了国内外各方面的资料 ,写就本文。本文概述了鹅膏菌多肽毒素的种类、鹅膏菌毒素中毒反应及病理学症状、机体对鹅膏菌毒素的吸收、鹅膏菌毒素的毒性和毒理以及鹅膏菌毒素在生命科学研究中的应用 ,为国内这方面的研究提供了参考。

7种鹅膏菌属真菌肽类毒素的HPLC分析(英文)

利用HPLC法对长白山地区分布的7种鹅膏属真菌成熟子实体中的α鹅膏毒肽(αamanitin)、β鹅膏毒肽(βamanitin)和鬼笔毒肽(phalloidin)的含量进行了测定。结果表明:芥橙黄鹅膏(Amanitasubjunquillea)和橙黄鹅膏(Amanitaaff.citrina)中均含有3种毒素,其中芥橙黄鹅膏的α鹅膏毒肽含量为2395.91μg/g、β鹅膏毒肽含量为1653.75μg/g和鬼笔毒肽含量为405.26μg/g;橙黄鹅膏的分别为1121μg/g、4244μg/g和9442μg/g。芥橙黄鹅膏白色变种(Amanitasubjunquilleavar.abla)中含有β鹅膏毒肽,其含量为614.00μg/g。其他5种鹅膏中均未检测到上述3种毒素。

细胞松弛素B和鬼笔环肽对梨花粉萌发和花粉管生长的影响

以砂梨(Pyrus pyrifoliaNakai)品种今村秋(Imamuraaki)和丰水(Hosui)为材料,分别用光学显微镜和荧光显微镜观察了离体和半活体条件下微丝骨架解聚剂细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)和稳定剂鬼笔环肽(phalloidin)对梨花粉萌发和花粉管生长的影响.结果表明:(1)低浓度(10μg/mL)鬼笔环肽能促进花粉萌发和花粉管生长,但高浓度对花粉萌发和花粉管的生长具有抑制作用;CB抑制花粉萌发和花粉管生长,且抑制效应随其浓度的增加而增强.(2)鬼笔环肽处理柱头后进行自花授粉,可明显促进自花花粉萌发和花粉管的生长,而CB处理柱头后异花授粉则抑制异花花粉萌发及其花粉管生长.可见,微丝骨架参与了梨花粉萌发和花粉管生长过程,并参与了梨自交不亲和反应的调节.

长链非编码CDKN2B调控miR-19对慢性髓细胞白血病的影响

目的:探讨长链非编码CDKN2B调控miR-19的表达影响慢性髓细胞白血病细胞的生物学行为的方式及其机制。方法:q PCR检测不同白血病细胞中CDKN2B的表达情况;双荧光素酶报告基因检测CDKN2B与miR-19的相互作用;MTT增殖实验和流式细胞检测CDKN2B对HL-60细胞增殖和凋亡的影响;划痕愈合实验检测沉默CDKN2B后白血病HL-60细胞迁移能力的变化;Transwell侵袭实验检测沉默CDKN2B后白血病HL-60细胞侵袭能力的变化;划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测沉默CDKN2B后miR-19对HL-60细胞迁移和侵袭能力的影响;鬼笔环肽染色检测沉默MEG3后细胞骨架微丝微管形态变化;Western blot检测沉默CDKN2B后PI3K/AKT信号通路蛋白的表达情况。结果:在HL-60细胞中CDKN2B表达水平最低;CDKN2B能与miR-19的3'UTR特异性结合;过表达CDKN2B可以抑制HL-60细胞增殖能力,促进其凋亡行为;沉默CDKN2B可以增强白血病HL-60细胞侵袭和迁移能力;过表达CDKN2B后细胞骨架表现为伪足减少,运动能力减弱;肌动蛋白表达水平下调;过表达CDKN2B后PI3K/AKT通路蛋白表达情况相应下调。结论:CDKN2B可以靶向调节miR-19调控白血病细胞生物学行为。

F-肌动蛋白是蒜根端分生组织细胞核和染色体的组成成分

以兔抗鸡肌动蛋白抗体为一抗、ＦＩＴＣ羊抗兔ＩｇＧ抗体为二抗进行间接免疫荧光标记实验，观察到蒜（ＡｌｉｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ．）根端分生组织细胞核和染色体均发出明亮的黄绿色荧光，说明其中含有肌动蛋白。经ＴＲＩＴＣ鬼笔环肽标记后，完整的间期细胞、游离的间期细胞核、前期和中期染色体以及末期子细胞核均发出较强的红色荧光，而固定前用细胞松弛素Ｄ处理的根端分生组织细胞的荧光明显减弱或没有荧光，这些结果说明细胞核和染色体中存在着Ｆ肌动蛋白。抗肌动蛋白抗体和鬼笔环肽双标记实验结果指出，同一细胞核和染色体，在ＦＩＴＣ的激发光波长下发出代表总肌动蛋白的黄绿色的ＦＩＴＣ型荧光，在ＴＲＩＴＣ的激发光波长下则发出代表Ｆ肌动蛋白的红色的ＴＲＩＴＣ型荧光，两类荧光的分布是一致的。上述结果进一步证明Ｆ肌动蛋白是细胞核和染色体的组成成分，并说明Ｆ肌动蛋白可能是细胞核和染色体中肌动蛋白的主要存在方式。

黄盖鹅膏中二羟鬼笔毒肽(PHD)的抗肿瘤活性研究

采用MTT法研究了从黄盖鹅膏(Amanita subjunquillea S.Imai)子实体中分离纯化的二羟鬼笔毒肽对胃癌细胞(SGC)和肝癌细胞(SMMC-7721)增殖的体外抑制作用,并对H22荷瘤小鼠进行了体内抗肿瘤试验。结果表明:二羟鬼笔毒肽对SGC和SMMC-7721体外细胞增殖无抑制作用,但对H22荷瘤小鼠有明显的抑瘤作用,剂量为0.3mg/kg时,抑瘤率可达65.15%。

洋水仙花粉和花粉原生质体中肌动蛋白微丝分布变化的共焦显微镜观察

用荧光标记的鬼笔环肽作为肌动蛋白微丝的探针,结合共焦显微镜技术,观察了洋水仙(Narcissus cyclamineus)花粉及花粉原生质体中微丝骨架的分布变化情形。在水合而未萌发的花粉粒中,存在于周质的微丝束多数与花粉粒的长轴呈直角排列。但在萌发沟部位,微丝束的排列则呈网状。在花粉粒的周质至中央部位,微丝束形成另一种形式的网络,在结构上比在萌发沟部位的网络疏松。当花粉开始萌发时,存在于花粉粒内的微丝束逐步转变为平行排列状,并向花粉管伸长的方向延伸和聚集。在脱壁后的花粉原生质体内,微丝束经过重组形成一个结构复杂和排列紧密的网络。原生质体经低渗爆破处理或Triton X-100等过程抽提离析,在遗留下来的膜层上仍然可以见到微丝束残迹,显示微丝与膜层关系密切。用双染法同时显示微管和微丝,表明两者的分布有重叠现象,说明微管和微丝骨架的分布并不是随机的,而可能是由同一种结构或机制控制着。

辽宁树莓园红鬼笔发生初报及种类鉴定

在沈阳市东陵区祝家屯镇下楼子村树莓栽培园田间地表首次发现一种大量生长的奇特真菌,经鉴定确认该菌为红鬼笔(Phallus rubicundus(Bosc.)Fr.),属于属真菌门,担子菌亚门,腹菌纲,鬼笔目,鬼笔菌属。通过田间发生调查、菌种分离鉴定及室内培育观察,对红鬼笔生态、形态与生长特征进行了初步研究。

优化大鼠肺动脉平滑肌细胞骨架F-actin图像的激光共聚焦显微技术

目的:优化大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)骨架蛋白F-actin图像的激光共聚焦显微技术。方法:采用不同浓度梯度的荧光染料及不同孵育条件,应用激光共聚焦显微扫描技术对PASMCs细胞骨架F-actin进行形态学观察。结果:终浓度10 mg/mL FITC-鬼笔环肽及10 mg/mL PI,分别染色30 min,并经RNA酶37℃处理为最适实验条件,可见F-actin呈明亮细丝状绿色荧光,PI标记的胞核呈红色荧光,胞浆无明显PI染色。结论:通过对染色条件的最终优化,表现出激光共聚焦技术在平面及三维同时观察细胞骨架F-actin的优越性,为进一步实验提供良好的技术平台。

小麦胚乳细胞中肌动蛋白纤丝分布格局的荧光显微观察

以异硫氰四甲基罗丹明－鬼笔环肽为探针，结合电视显微镜术对呈现原生质胞间运动的小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）胚乳细胞胞质中肌动蛋白纤丝（ＡＦｓ）的存在与分布格局进行了观察与分析。结果表明，ＡＦｓ以多种形式在胚乳细胞内呈区域性分布：胞核为ＡＦｓ网络所包围，ＡＦｓ成束由核周向四处辐射直抵周质层，大量纤细ＡＦｓ在胞质皮层内呈无序的密集分布以及腹沟区细胞内ＡＦｓ梭状体的大量汇集。联系胞质组分在胞间运动中的动态与胞质纤索对ＣＢ处理的反应。

肌动蛋白在丝瓜花粉管顶端生长中的作用

用非固定荧光标记的鬼笔环肽作为肌动蛋白探针观察并证明了丝瓜未萌发的花粉粒和不同生长时期花粉管中肌动蛋白纤丝的分布及其形态变化。又用细胞松弛素B（CB）、氯两嗪（CPZ）及N-乙酰马来酰胺（NEM）证明了丝瓜花粉管伸长与肌动蛋白既有密切的关系，也受Ca2+的调节。

百合花粉原生质体中肌动蛋白微丝的荧光共焦镜观察

用TRITC-鬼笔碱作为显示肌动蛋白的荧光显微探针,观察了百合Lilium hollandiumx L.tigrinum近成熟和刚成熟花粉原生质体中微丝的三维分布格局。原生质体的分离是在含有果胶酶和纤维素酶的B_(?)培养基中进行的。在近成熟的花粉原生质体中肌动蛋白的网络系统是由粗微丝束组成的。而在刚成熟的花粉原生质体中则是由较为幼细、稠密的微丝束组成。在近成熟和刚成熟的花粉原生质体中的生殖细胞内又另有一个微丝网络。一些原生质体网络内微丝束分支和交叉点清晰可见。如把这两种不同成熟期的花粉原生质体置放在适于花粉萌发的BK培养基内培养时,原生质体会逐渐液泡化,经数小时后,大液胞把原生质体内的胞质分隔开,形成许多胞质纤维束,在这些液胞化的原生质体的胞质内,微丝的分布除集中在生殖细胞和营养核周围形成一个紧密的网络外,还在胞质纤维束内形成许多粗微丝束,这些粗微丝束的其中一端常与膜层紧密相连接,显示微丝和膜层有着密切关系。

细胞松弛素B和鬼笔环肽对梨花粉管钙离子浓度和尖端钙离子通道的影响

应用激光共聚焦显微镜和全细胞膜片钳技术研究了微丝骨架解聚剂细胞松弛素B(CB)和稳定剂鬼笔环肽(PD)对梨花粉管细胞内钙离子浓度动态变化和尖端质膜上钙离子通道的影响。结果显示:CB处理能促进花粉管内胞质钙离子[Ca2+]i浓度增加,同时还能激活质膜上的钙离子通道;而PD处理对花粉管内[Ca2+]i浓度及钙离子通道几乎没有影响。研究表明,微丝骨架的解聚激活了花粉管质膜上的钙离子通道,使得胞外钙离子大量流入,胞内钙离子浓度升高,从而抑制花粉管生长。