甘薯PHB基因家族的全基因组鉴定和表达分析

蛋白质抑制素(prohibitin,PHB)是在原核生物到真核生物中发现的含有SPFH结构域的蛋白质。植物PHB基因家族参与多种不同生物过程的重要功能,包括生长发育以及对生物和非生物胁迫的响应。目前PHB蛋白在拟南芥、水稻、玉米、大豆、番茄和陆地棉等多种植物中被鉴定。但对甘薯中PHB家族的系统分析仍未确定。本研究鉴定出甘薯11个PHB基因,且对这些保守的蛋白质基序和基因结构的分析显示它们在系统发育亚群中具有高度的保守性。此外,启动子区域预测出与多种激素调节及胁迫相关的顺式作用元件,同时研究发现IbPHB基因在植物不同部位及受到不同的非生物胁迫时的表达模式存在差异。本研究系统分析了甘薯中IbPHB基因的一般特性,为甘薯及其他植物中PHB基因的功能特性研究提供了理论基础。

美仁牦牛PHB基因克隆及组织表达

为研究美仁牦牛抗增殖蛋白(PHB)的结构及功能,并探究其在7日龄牛和成年牛的各组织中的表达情况。以美仁牦牛肾脏组织cDNA为模板克隆美仁牦牛PHB基因序列。对基因序列进行生物信息学分析以及对蛋白质进行理化性质预测,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测PHB基因在美仁牦牛2个年龄段8个组织中的相对表达量。结果表明,美仁牦牛PHB基因的CDS区全长819 bp,共编码272个氨基酸;同源性比对发现美仁牦牛与普通牛的同源性最高(99.1%);美仁牦牛PHB蛋白分析显示,PHB蛋白内存在1个N-糖基化潜在位点和2个O-糖基化潜在位点,其氨基酸等电点为5.55,不稳定系数(Ⅱ)为46.07,总平均疏水性为0.045,预测为不稳定疏水性蛋白质;亚细胞定位显示,PHB蛋白位于线粒体(30.4%),蛋白内共有潜在磷酸化位点15个,PHB蛋白高级结构由α-螺旋(56.25%)、无规则卷曲(22.43%)、延伸链(16.54%)和β-转角(4.78%)相互连接而成。RT-qPCR结果显示,美仁牦牛2个发育阶段的8个组织中均有PHB基因的表达。在对比2个时期的PHB基因组织表达规律后发现,7个组织的PHB基因表达量随美仁牦牛的生长发育而降低,在美仁牦牛肝脏、脾脏、肺脏、脂肪和睾丸组织中,PHB基因表达量随年龄显著降低(P<0.05)。

油菜叶绿体基因组同源重组片段的克隆及phb基因定点整合载体的构建

利用叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点 ,根据烟草、水稻和玉米叶绿体基因组全序列资料 ,设计合成引物 ,PCR扩增并克隆了油菜叶绿体两个重要的功能基因rbcL和atpB(GenBank登录号分别为AF2 67640和AF2 67641) ,并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。以来自叶绿体的强启动子PpsbA和Prrn等驱动PHB合成途径中 3个关键酶基因phbA、phbB和phbC ,分别构建表达盒 ,并将它们按照其在原始菌株中的自然转录顺序phbC phbA phbB相串联 ,最后连同选择标记基因aadA表达盒一起 ,克隆到油菜叶绿体同源片段中 ,构建成phb基因定点整合载体pRCABZ和pRCABF。酶切及Southern杂交结果证明所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。

陆地棉PHB基因家族鉴定与表达分析

抑制素(prohibitin,PHB)是一类普遍存在的高度保守蛋白,与植物的生长发育和生物及非生物胁迫等生物过程密切相关。目前,PHB蛋白在拟南芥、水稻和大豆等多种植物中已被鉴定,然而在陆地棉中尚未进行系统鉴定。本研究通过生物信息学方法鉴定了28个PHB基因家族成员,保守基序和基因结构分析证实了PHB蛋白的系统发育关系。此外,启动子区域预测出与多种激素调节及胁迫相关的顺式作用元件,同时研究发现GhPHBs在植物不同部位及受到不同的非生物胁迫时的表达模式存在差异。本研究系统分析了陆地棉中GhPHBs基因的一般特性,为陆地棉及其他植物中PHB基因的功能特性研究提供了理论基础。

水牛PHB基因克隆与表达模式

本研究克隆水牛PHB(prohibitin)基因并运用生物信息学方法对其进行分析,同时初步探索其表达模式。首先应用RT-PCR技术扩增获得水牛PHB基因片段,应用生物信息学方法分析和预测了其理化性质、蛋白质二级及三级结构。测序结果表明,水牛PHB基因编码区全长948bp,推测编码272个氨基酸,理论蛋白质相对分子质量29 830,等电点为5.58。多重序列比较分析显示,水牛PHB基因核苷酸序列与牛、野猪、羊、黑猩猩、人、小鼠等相应序列相似性分别为99.4%,94.3%,97.8%,92.8%,92.9%,89.6%;系统进化树分析结果推测,PHB基因在不同物种以及进化过程中具有高度的保守性。QRT-PCR分析结果显示,水牛PHB基因在垂体、大脑、肝脏、卵巢、肌肉、肾脏和睾丸组织具有不同程度的表达,其中在肾脏表达量最高,肝脏、睾丸、卵巢和垂体次之,肌肉表达最低。对高、低活率水牛精子样本PHB基因表达进行了定量检测,结果显示高活率精子中PHB基因表达显著高于低活率精子(P<0.05)。Western blot分析结果发现,高、低活率精子样品的β-actin蛋白条带清晰一致,PHB蛋白在高、低活率精子样品的表达差异显著,低活率精子样品的PHB蛋白表达下调,这与mRNA水平的检测结果一致。本研究为阐明PHB基因在水牛精子发生过程中的作用及其对水牛精子活率的影响奠定了基础。

多功能基因工程菌VG1(pTU14)产PHB的氮源代谢

为降低PHB生产过程中的发酵成本和分离成本,以大肠杆菌为宿主成功构建了溶氧利用能力高且可诱导裂解破壁的新型PHB高产多功能基因工程菌VG1(pTU14)。由于该重组菌同时表达透明颤菌血红蛋白基因、λ噬菌体裂解基因及PHB合成基因这3种外源基因,故其氮源代谢特性不同于一般的基因工程菌。实验证明,无机氮源和有机氮源,尤其是有机氮源的种类及浓度均对重组菌生长和PHB积累有重要影响,且二者之间存在很强的交互作用。进一步实验表明,重组菌VG1(pTU14)的最佳无机氮源为乙酸铵,优化质量浓度为2.0 g/L;最佳有机氮源为酵母浸膏粉,优化质量浓度为6.0 g/L。在0.03 g/L及0.4 g/L两种质量浓度下分析酵母浸膏粉中的17种氨基酸对重组菌生长和PHB积累的影响,表明无论在何种质量浓度水平下,精氨酸均是促进菌体生长和PHB积累的一种最重要的氨基酸;而谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、色氨酸、脯氨酸等也均显著促进重组菌生长和PHB积累;但亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、胱氨酸等反而不利于菌体的生长和PHB的积累。

Simultaneous Expression of Vitreoscilla Globin Gene and Lytic Genes of Phage A in a Novel Recombinant Escherichia Coli Used for Production of PHB

Exogenous Vitreoscilla globin gene (vgb), lytic genes of phage A with S amber mutation (S-RRz) and poly(B-hydroxybutyrate) (PHB) biosynthetic genes (phbCAB) were cloned into a same Escherichia coli cell, simultaneously or respectively. Six novel strains containing phbCAB and vgb with or without lytic genes were constructed. Strain VG1 (pTU14), in which vgb, phbCAB and S-RRz could all be successfully expressed, has superior characteristics in cell growth and PHB accumulation, while the results of strains containing vgb and phbCAB without S- RRz were not better than that of strains harbored ph&CAB only. The simultaneous expression of vgb and S- RRz in the recombinant VG1 (pTU14) showed a great potential for low-cost production of PHB.