PHI调控Molt-4细胞组蛋白甲基化诱导p15基因去甲基化后再表达

本研究探讨异硫氰酸苯己酯(PHI)对急性T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞组蛋白H3K4、H3K9甲基化,及p15基因的去甲基化的调控作用及诱导沉默基因重新表达的机制。用Western blot方法检测PHI作用后Molt-4细胞的组蛋白H3K4、H3K9甲基化状态及P15蛋白的表达的变化;应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测PHI作用前后Molt-4细胞株p15基因甲基化状态的变化;半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Molt-4细胞经过PHI处理后p15基因的mRNA的表达变化。结果表明,PHI作用于Molt-4细胞可增强组蛋白H3K4甲基化表达,抑制组蛋白H3K9甲基化表达,并呈浓度及时间依赖性;PHI作用于Molt-4细胞5天后,p15基因的甲基化程度减弱,p15基因的异常高甲基化现象被逆转,沉默的p15基因重新表达;p15 mRNA、P15蛋白表达增加,并呈浓度依赖性。结论:PHI可能通过特异性调节组蛋白H3K4、H3K9甲基化水平,引起染色体空间结构发生变化,使p15基因的CPG岛去甲基化,从而诱导p15基因重新表达。

异硫氰酸苯已酯抑制骨髓瘤细胞Notch信号表达的研究

为了研究异硫氰酸苯已酯(phenylhexyl isothiocyanate,PHI)在体外对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖抑制的分子机制,用不同浓度PHI与RPMI8226细胞共同孵育,用MTT比色法检测PHI处理后细胞增殖抑制;用DAPI染色观察PHI处理后细胞凋亡;Western blot检测PHI处理后瘤细胞Notch1、Jagged2、BCL-2和p-Akt蛋白表达变化。结果显示,PHI在一定浓度范围内能抑制瘤细胞增殖,诱导瘤细胞凋亡,其抑制效应具有时间和浓度依赖性。PHI可以下调瘤细胞中Notch1和Jagged2蛋白的表达并呈时间和浓度依赖性,同时降低BCL-2和p-Akt的表达。结论:PHI在体外能够抑制骨髓瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡;细胞凋亡的发生与PHI抑制Notch信号及其下游靶基因p-Akt和BCL-2的表达有关,PHI可能成为新一代的Notch信号抑制剂,是一种潜在的骨髓瘤治疗药物。

异硫氰酸苯乙酯对K562／A02细胞阿霉素耐药影响的研究

本实验研究探讨异硫氰酸苯乙酯(phenylhexyl isothiocyanate,PHI)对K562/A02细胞的阿霉素(ADM)耐药性与敏感性的影响,并研究其可能的相关机制。运用MTT法分别检测阿霉素(ADM)以及PHI+ADM对K562/A02细胞的生长抑制率,计算其耐药倍数;用流式细胞仪检测PHI作用前后细胞的凋亡、细胞内ADM浓度的变化和MRP1蛋白变化;分光光度仪测定细胞内还原性谷胱目肽(GSH)的含量;RT-PCR半定量检测PHI作用前后MRP1mRNA的水平。结果显示,随着PHI浓度的增加,细胞生存率降低;两药联合应用时K562/A02细胞凋亡率均增加;当PHI≥20μmol/L时其耐药倍数有显著差异(p<0.05),两种细胞内ADM浓度增加亦有显著差异(p<0.05)。单独运用1μg/ml ADM时K562/A02细胞内的GSH含量下降5%,单独运用PHI时K562/A02细胞内的GSH含量随着PHI浓度的增加先是轻度升高尔后下降,GSH含量下降点约在10μmol/L;当PHI≥20μmol/L与1μg/mlADM联合应用时,K562/A02细胞内的GSH含量随着PHI浓度的升高而进行性下降;而不同浓度的PHI的作用前后,两种细胞的MRP1的表达无论是蛋白水平还是基因水平都无显著差异(p>0.05)。结论:PHI对K562/A02细胞的细胞毒作用与细胞内GSH耗竭无直接关系,PHI不但可以增强K562/A02细胞对ADM的敏感性,而且通过耗竭细胞内GSH部分地逆转K562/A02细胞对ADM的耐药。联合使用PHI可减少ADM的用量,从而降低其毒副作用。

异硫氰酸苯己酯诱导骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

为了评价异硫氰酸苯己酯(phenylhexly isothiocyanate,PHI)体外对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖和分化的影响,用不同浓度的PHI与RPMI8226细胞共同孵育,用原位末端标记法(TUNEL)检测PHI处理后细胞凋亡,流式细胞术分析PHI处理后的细胞周期变化;以JC-1为探针,检测PHI处理后瘤细胞线粒体膜电位的变化,用定量夹心ELISA方法检测PHI处理后瘤细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)的变化。研究结果显示,PHI在低浓度(0.5μmol/L)时显著抑制瘤细胞增殖,诱导瘤细胞发生凋亡,抑制效应与PHI浓度有关,PHI处理后细胞生长停滞在G0/G1期。用10μmol/LPHI处理瘤细胞48小时后,线粒体去极化和膜电位丢失较对照组增加3-4倍,瘤细胞分泌VEGF显著减少,仅为对照组的35%。结论:PHI在体外能够抑制骨髓瘤细增殖,诱导细胞凋亡;细胞凋亡的发生与线粒体去极化和膜电位丢失有关,PHI抑制瘤细胞VEGF的分泌可能是引起细胞凋亡原因之一,PHI是一种潜在的骨髓瘤的治疗药物。

异硫氰酸苯己酯降低U266细胞株p16基因甲基化的研究

本研究探讨异硫氰酸苯己酯对p16基因高甲基化的多发性骨髓瘤U266细胞株是否有去甲基化的作用。用异硫氰酸苯己酯0、5、10μmol/L孵育U266细胞株,提取DNA备用。用亚硫酸氢盐处理正常人基因组DNA,并以此为模板进行PCR扩增。设计1组特殊荧光标记探针以构建1种检测p16基因启动子区3个CpG位点甲基化改变的芯片,特殊荧光标记探针包括1对非甲基化探针和甲基化探针,检测相邻的3个CpG位点甲基化的程度。采用基因芯片的方法,将完全未甲基化的DNA和完全甲基化的DNA混合后制成标准曲线,将U266细胞株样本处理后点在芯片上与标准曲线进行比较后得出定量检测的结果。结果表明:芯片上探针的可重复性和精确性很好,0、5、10μmol/L异硫氰酸苯己酯处理后的U266细胞株p16基因的甲基化程度分别为78.2%、61.7%、54.8%。结论:异硫氰酸苯己酯可以降低U266细胞株p16基因甲基化的程度。

PHI对Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株组蛋白甲基化和乙酰化调控的实验研究

本研究观察异硫氰酸苯己酯(PHI)在体外对Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株的作用及对淋巴瘤细胞表观遗传学调控的影响,初步探讨其可能的机制。用流式细胞术检测PHI处理后的细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法检测PHI处理后的细胞的组蛋白H3、H4乙酰化和H3K4、H3K9甲基化状态改变。结果表明,PHI诱导细胞凋亡并提高组蛋白H3、H4乙酰化水平,组蛋白H3K4甲基化增强,而H3K9甲基化减弱。结论:PHI能上调与转录激活相关的组蛋白H3乙酰化水平及甲基化H3K4,下调转录抑制相关的组蛋白甲基化H3K9,促进肿瘤细胞凋亡,PHI可作为淋巴瘤的靶向治疗药物。

异硫氰酸苯已酯抑制T细胞白血病Jurkat细胞Wnt／β-catenin信号通路的研究

本研究目的在于探索研究异硫氰酸苯己酯(PHI)在体外对人类T细胞白血病Jurkat细胞Wnt/β联蛋白(catenin)信号通路及组蛋白调控、细胞凋亡和增殖的影响。用MTT方法检测PHI作用后Jurkat细胞的增殖率变化;用流式细胞术观察细胞凋亡;用Western blot观察Jurkat细胞Wnt/β-catenin信号转导通路相关蛋白β-catenin、TCF、c-myc、cyclinD1水平的变化,以及组蛋白甲基化H3K4,H3K9、乙酰化H3,H4的变化。结果表明,PHI可抑制Jurkat细胞增殖,诱导细胞凋亡,呈浓度和时间依赖性,48 h的IC50约为20μmol/L;PHI处理3 h后上调组蛋白乙酰化H3、H4和组蛋白甲基化H3K4,下调组蛋白甲基化H3K9,7 h时作用更明显;PHI作用3 hβ-catenin表达水平无变化,7 h后Wnt/β-catenin信号转导通路β-catenin及其周期相关基因TCF、c-myc、cyclinD1表达均下降。结论:PHI抑制Jurkat细胞Wnt/β-catenin信号转导通路,调控组蛋白甲基化、乙酰化,从而诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖。

异硫氰酸苯已酯诱导骨髓瘤U266细胞P16基因去甲基化

目的研究异硫氰酸苯己酯(PHI)对骨髓瘤U266细胞株P16基因的去甲基化作用并探讨其作用机制。方法应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测U266细胞经过PHI处理后DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA的表达变化,用甲基化特异性聚合酶链反应检测PHI作用前后U266细胞株P16基因甲基化状态的变化。结果使用不同浓度的PHI处理U266细胞72h后,U266细胞表达DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA的水平明显降低并呈浓度依赖性。以不同浓度的PHI处理U266细胞10d后,P16基因的甲基化状态被逐渐逆转。结论 PHI可能通过抑制DNA甲基转移酶的表达水平诱导P16基因产生去甲基化,使失活的抑癌基因重新激活,诱导瘤细胞凋亡。

苯己异硫氰酸酯通过抑制组蛋白去乙酰化和诱导去甲基化来抑制MDS细胞生长

目的为了探索治疗骨髓增生异常综合征(mylodysplasia syndrome,MDS)新的一类靶向药物,笔者研究了苯己异硫氰酸酯(phenylhexyl isothiocyanate,PHI),1种合成的萝卜硫素(sulforphate,SFN)衍生物对MDS细胞作用。方法 MDS细胞株SKM-1经过不同浓度PHI处理3个平行孔后使用台盼蓝拒染法测定细胞活力,流式细胞术分析细胞周期相,荧光染料JC-1检测线粒体膜电位改变;甲基化特异性PCR检测去甲基化改变,Western blot法蛋白印迹分析p^(15)基因表达和组蛋白乙酰化程度,以及ELISA法测定细胞培养上清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的含量。结果经过5μmol/L PHI处理后MDS细胞增殖受到抑制和产生凋亡,在诱导浓度低至10μmol/L细胞增殖减少了50%,和细胞周期分析显示MDS细胞停滞在细胞G_1期,PHI诱导p^(15)基因去甲基化呈现浓度依赖性,进一步证明也以浓度依赖方式PHI诱导组蛋白H3高乙酰化。同时也表明,PHI抑制MDS细胞中VEGF产生,以及通过破坏线粒体膜电位诱导细胞凋亡。结论 PHI可以诱导p^(15)基因去甲基化和组蛋白H3高乙酰化,具有对MDS p^(15)基因去甲基化和组蛋白高乙酰化的双重表观遗传效应,从而启动了靶向途径抑制MDS细胞增殖。

异硫氰酸苯己酯诱导Molt-4细胞p15基因去甲基化及机制研究

研究新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂异硫氰酸苯己酯(PHI)对急性T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞p15基因的去甲基化作用及诱导沉默基因重新表达作用,并进一步探讨其作用机制。应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测PHI作用前后Molt-4细胞株p15基因甲基化状态的变化;半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Molt-4细胞经过PHI处理后DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、p15基因的mRNA的表达变化;用蛋白免疫印迹(Western blotting)检测Molt-4细胞经过PHI处理后的P15蛋白的表达。结果显示,PHI作用于Molt-4细胞5d后,p15基因的甲基化程度减弱,p15基因的异常高甲基化现象被逆转,沉默的p15基因重新表达,p15mRNA、P15蛋白表达增加,并呈浓度依赖性;PHI可下调DNMT1和DNMT3B的mRNA表达(P<0.05),而对DNMT3A的mRNA表达作用不明显(P>0.05)。PHI可能通过抑制DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3B的活性,诱导p15基因产生去甲基化,或者(和)是通过改变p15基因附近组蛋白的乙酰化水平,导致染色体空间结构发生变化,增加转录因子的进入,从而诱导p15基因重新表达。

异硫氰酸苯己酯对Molt-4细胞组蛋白甲基化、乙酰化调控的实验研究

目的研究异硫氰酸苯己酯(PHI)在体外对淋巴细胞白血病 Molt-4细胞系的作用,观察 PHI 对 Molt-4细胞组蛋白甲基化、乙酰化调控的影响。方法采用 MTF 法、克隆抑制实验观察 PHI对 Molt-4细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测 PHI 诱导细胞凋亡和对细胞周期的影响;用 Westernblot 法观察 PHI 作用后细胞的组蛋白乙酰化酶、组蛋白甲基化及乙酰化状态的变化。结果 PHI 可上调 Molt-4细胞组蛋白乙酰化酶 P300/CBP 水平,显著提高组蛋白 H3、H4乙酰化及 H3K4甲基化水平,抑制组蛋白甲基化 H3K9表达,阻滞细胞于 G_0/G_1期,并诱导细胞凋亡。结论 PHI 可能是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,同时能调控组蛋白甲基化,影响其表观遗传学,可能作为新的抗白血病治疗药物。

异硫氰酸苯己酯对SMMC-7721细胞甲基化和乙酰化组蛋白表达及细胞生长和凋亡的影响

目的研究异硫氰酸苯己酯（PHI）在体外对原发性肝癌细胞株SMMC-7721细胞的作用，观察PHI对SMMC-7721细胞甲基化和乙酰化组蛋白表达及细胞生长和凋亡的影响。方法采用锥虫蓝拒染直接计数法观察PHI对SMMC-7721细胞增殖的影响；原位末端标记法观察PHI对SMMC7721细胞凋亡的作用；用Westernblot方法观察PHI作用后SMMC-7721细胞组蛋白H3K4、H3K9甲基化及组蛋白H3、H4乙酰化状态的改变。计量资料实验数据以均数±标准差（x-±s）表示，进行单因素方差分析。结果PHI处理后的细胞增殖受抑制；0、10、20、40μmol／LPHI处理7h后，细胞凋亡率分别为4．50％±2．33％、6．85％±2．43％、17．50％±4．15％、54．50％±3．41％，差异有统计学意义（F=34．22，D〈0．05）；PHI显著提高组蛋白乙酰化H3、H4及甲基化H3K4水平，抑制组蛋白甲基化H3K9表达。结论PHI可能是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，同时能调控组蛋白甲基化，影响其表观遗传学特性，可能作为新的抗癌药物。

异硫氰酸苯己酯调控肝癌细胞株SMMC-7721组蛋白乙酰化及诱导细胞凋亡

目的 研究异硫氰酸苯己酯（PHI）对肝癌SMMC-7721细胞组蛋白乙酰化调控及凋亡的影响.方法 采用台盼蓝拒染直接计数法观察PHI对SMMC-7721细胞增殖的影响,采用原位末端标记（TUNEL）法检测PHI对SMMC-7721细胞凋亡的影响,采用Western blot法检测PHI对SMMC-7721细胞组蛋白乙酰化及凋亡相关蛋白表达的影响.结果 PHI可抑制SMMC-7721细胞的增殖,与0 μmol/L作用组比较,5、10、20、40和80 μmol/L的PHI对SMMC-7721细胞均有不同程度的增殖抑制作用.PHI可诱导SMMC-7721细胞产生凋亡,PHI作用于SMMC-7721细胞7 h后,10、20和40 μmol/LPHI组的细胞凋亡率分别为6.9%±2.4%、17.5%±4.2%和54.5%±5.4%,明显高于0 μmol/L PHI组（4.5%±2.3%,P＜0.05）.PHI作用于SMMC-7721细胞3 h时,与0 μmol/L PHI组比较,10、20和40 μmol/L PHI组中Bcl-2、Procaspse-9和Procaspse-3的表达下降,caspase-9和caspase-3的表达上升,而Procaspase-8的表达未见明显变化;作用7 h时,这种变化趋势更加明显.PHI作用于SMMC-7721细胞3 h时,与0 μmol/L PHI组比较,10、20和40 μmol/L PHI组中组蛋白H3的乙酰化分别增加了1.87倍、2.43倍和3.67倍,组蛋白H4的乙酰化分别增加了1.29倍、1.45倍和2.25倍;作用7 h时,这种变化趋势更加明显.结论 PHI是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,可调控组蛋白的乙酰化水平,影响其表观遗传学,并通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡.

异硫氰酸苯己酯诱导Molt-4细胞p15基因去甲基化的实验研究

目的研究异硫氰酸苯己酯（PHI）对急性T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞p15基因的去甲基化作用及转录激活作用。方法采用甲基特异性聚合酶链反应（MSP）检测PHI作用前后Molt-4细胞株p15基因甲基化状态的变化情况；RT-PCR检测p15基因的mRNA的表达变化；Western blotting检测p15蛋白的表达变化。结果PHI作用于Molt-4细胞5d后，p15基因的异常甲基化现象被逆转，基因的甲基化程度减弱；基因转录激活，p15 mRNA、p15蛋白表达呈浓度依赖性增加。各组p15 mRNA条带灰度值与β-actin比值为：空白对照组（0．17±0．12），PHI 10μmol／L组（0．29±0．14），PHI 20μmol／L组（0．55±0．07），PHI 40μmol／L组（0．93±0．13），各加药组与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论PHI有DNA去甲基化的作用，能诱导沉默的p15基因重新表达。

PHI逆转K562/A02细胞阿霉素耐药的机制

目的探讨异硫氰酸苯乙酯(PHI)逆转K562/A02细胞株阿霉素(ADM)耐药的可能机制。方法将耐ADM的人慢性粒细胞白血病K562/A02细胞株分别与不同浓度(0,5,10,20,30,40和50μM)的PHI共同孵育后,流式细胞术检测细胞周期、细胞内ADM浓度以及P-糖蛋白1(P-gp1)表达水平;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PHI作用前后细胞内mdrl mRNA的转录水平。结果与对照组相比,联合作用48h后,随着PHI浓度的增加G2期细胞逐渐减少,G1期细胞明显增多,而S期细胞无明显变化;K562/A02细胞内ADM平均荧光强度均高于对照组;K562/A02细胞mdrl mRNA表达下降和P-gp1表达下调(P<0.05)。结论 PHI逆转K562/A02细胞耐药机制可能与细胞G1期阻滞和P-gp1表达下调有关。

异硫氰酸苯己酯对K562／G01细胞伊马替尼耐药性的影响

目的体外观察异硫氰酸苯己酯（PHI）对人慢性髓性白血病细胞株K562／G01细胞伊马替尼耐药性的影响，探讨其可能的机制。方法采用MTT法检测不同浓度的PHI和伊马替尼单独或联合处理对K562／G01细胞增殖的抑制作用。流式细胞术检测不同浓度的PHI和（或）伊马替尼作用下K562／G01细胞的凋亡率。Westernblot检测PHI处理K562／G01细胞后P—gP、P210^bcr-abl蛋白、磷酸化P210^bcr-abl蛋白（p-P210^bcr-abl）表达水平的变化。结果PHI单独处理24h可抑制K562／G01细胞增殖，诱导细胞凋亡。PHI浓度由0增至40Ixmol／L，细胞增殖抑制率由0增至（51．22-4-1．41）％，凋亡率由（3．764-1．46）％增至（35．354-3．70）％。浓度分别为10、20、40txmol／L的PHI与不同浓度伊马替尼联合处理后，伊马替尼的IC50分别为（10．494-1．24）、（6．334-1．42）、（0．854-0．17）μmoL／L。PHI20txmol／L和浓度为10、20Ixmol／L的伊马替尼分别共同作用24h后，K562／G01细胞凋亡率分别为（43．624-4．23）％和（55．414-4．35）％，较单用伊马替尼组及单用PHI组均明显升高。PHI浓度由0增至40txmol／L分别作用7h后，K562／G01细胞P210^bcr-abl／β-actin比值由0．9444-0．034降至0．392±0．025，p-P210^bcr-abl／β-actin比值由0．9064-0．019降至0．3614-0．021，但P—gP表达无明显变化。结论PHI能抑制K562／G01细胞增殖，诱导细胞凋亡。PHI与伊马替尼联合有协同作用，可部分逆转细胞对伊马替尼的耐药，其机制可能与抑制P210^bcr-abl和p-P210^bcr-abl蛋白表达有关。

异硫氰酸苯己酯对骨髓瘤细胞增殖抑制机制的体外研究

目的观察异硫氰酸苯己酯(PHI)体外抑制骨髓瘤细胞增殖的机制。方法 MTT检测PHI对骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖的影响;流式细胞术检测药物处理后细胞周期的变化;实时荧光定量PCR检测PHI对Jag2、发状相关增强子基因(Hes1)及人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)表达的影响。结果 PHI可抑制RPMI8226细胞增殖,使细胞滞留于G0/G1期。剂量较大的2个实验组较对照组,Jag2表达量的减少与PTEN表达量的增加具有统计学意义(P<0.05);各实验组较对照组Hes1表达量减少均具统计学意义(P<0.05)。结论 PHI可通过靶向抑制Notch信号,上调抑癌基因PTEN,抑制骨髓瘤细胞株的体外增殖。