荧光假单胞菌phlD基因的克隆、表达及功能

对荧光假单胞菌合成2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)操纵子的关键基因phlD进行了克隆,并采用E.coliBL21(DE3)/pET28 a(+)对phlD进行了诱导表达,其指导合成的PhlD蛋白融合表达后为42000 Da.生物信息学方法分析PhlD具有PKSⅢ型聚酮合酶的结构及催化聚酮缩合、酰基转移反应的功能,并推测PhlD催化底物丙二酸单酰辅酶A经过聚酮缩合途径合成间苯三酚及其衍生物.对重组菌进行了摇瓶发酵并检测出发酵液中确有产物间苯三酚的合成.

间苯三酚产生菌的筛选与发酵优化

为解决化学合成法生产间苯三酚环境污染严重的问题,本研究设计2对不同的扩增间苯三酚合成关键基因phlD的引物,对前期分离得到的270余株假单胞菌进行筛选。采用LC-MS法对筛选出的目标菌株进行发酵产物检测,并对菌株进行种属鉴定及系统发育树构建;采用HPLC法测定其间苯三酚的产量,再利用正交试验优化菌株的发酵培养条件。结果显示,引物2在筛选产间苯三酚菌株方面效果较好,经LC-MS检测验证,筛选得到的海洋生境假单胞菌LBF-96发酵产物为间苯三酚,其经生理生化鉴定及16S核糖体RNA(16S rRNA)基因序列分析,确定为芸薹假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)。该菌株在28 ℃、150 r/min条件下发酵培养至72 h时,间苯三酚的产量为0.23 g/L,经正交试验优化发酵培养条件后,菌株在30 ℃、pH 7.0、200 r/min条件下间苯三酚的产量最高,比优化前提高了39%。这是关于芸薹假单胞菌产间苯三酚的首次报道,为间苯三酚的生物合成提供了新的种质资源。