高酶活枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶phoA基因克隆表达及降解内毒素的应用

【背景】碱性磷酸酶有降解内毒素活性,在胃肠道中有预防和减弱肠道炎症的作用,不同的枯草芽孢杆菌能分泌不同酶活性水平的碱性磷酸酶,可能是该菌保健作用的一个值得重视的因素。【目的】筛选并分离出一株产高酶活碱性磷酸酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),对其phoA基因进行克隆并原核表达,研究其酶学性质并对内毒素进行降解研究。【方法】以有机质丰富的土壤环境微生物为样本,在有机磷筛选培养基中分离枯草芽孢杆菌,以4-硝基苯磷酸二钠盐(4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate,p-NPP)为底物进行酶活测定,筛选产高酶活碱性磷酸酶的细菌,克隆表达其phoA基因并研究重组PhoA的酶学特性,最后用小鼠试验证明该酶对降低内毒素LPS的毒性作用。【结果】筛选到14株产高酶活碱性磷酸酶枯草芽孢杆菌,并克隆一株最高酶活的枯草芽孢杆菌35-16-1的phoA基因,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中实现可溶性表达。研究纯化后PhoA的酶学性质,PhoA的最适反应温度为70℃;最适反应pH为9.8;Mg^(2+)对PhoA的酶活性呈激活作用,当Mg^(2+)为14 mmol/L时,激活作用最大;Ca^(2+)对PhoA的酶活性呈抑制作用;K^(+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)和Fe^(2+)对PhoA的酶活性无明显影响;以p-NPP为底物,在37℃下测得PhoA的Vmax为179.86μmol/(L·min),Km为2.38 mmol/L,kcat为246.83 s^(‒1)。最适条件下测得酶比活为6550.00 U/mg。在重组PhoA处理后,LPS对小鼠的毒性明显降低。【结论】枯草芽孢杆菌35-16-1的phoA基因能重组表达出高酶活性的碱性磷酸酶,对内毒素具有降解功能。

phoA为报告基因的甲型副伤寒沙门氏菌启动子文库的建立及初步鉴定

目的：构建以phoA为报告基因的甲型副伤寒沙门氏菌启动子文库。方法构建了以phoA为报告基因的“启动子陷阱载体” pPhoA，将甲型副伤寒沙门氏菌基因组DNA的随机酶切片段（500～1500 bp）连接到载体上，启动phoA表达产物与BCIP产生蓝色反应筛选启动子，经过PCR、测序、比对等分析文库质量。结果库容量达到30000个，覆盖基因组全长的2.6倍，同时验证了4个能够在加入BCIP的平板中表现出蓝色的菌落，发现了4个启动子插入片段。结论成功构建高质量的甲型副伤寒沙门氏菌启动子文库，为进一步研究甲型副伤寒沙门氏菌的基因表达与调控奠定了基础。

流加不同物质对大肠杆菌DB15(pAET-8)表达人表皮生长因子的影响

考察了在大肠杆菌DB15(pAET-8)表达人表皮生长因子(hEGF)过程中流加不同的物质——磷酸盐、蛋白胨和酵母抽提物等对人表皮生长因子表达的影响.在表达阶段单独流加磷酸盐虽然增加了表达初期的比生长速率,延长了菌体生长期,提高了菌体浓度,但hEGF产量却比对照组减少了57%.在表达阶段流加蛋白胨或酵母抽提物也未能提高hEGF的表达水平.表明氨基酸或核苷酸合成并不是hEGF表达的限速步骤,提高大肠杆菌DB15(pAET-8)合成三磷酸腺苷(ATP)的能力或许是提高hEGF表达的关键.

原发性肥大性骨关节病一例报告并文献复习

目的探讨原发性肥大性骨关节病(PHOA)的临床和X线特点,以提高对PHOA的认识。方法报告1例PHOA的临床表现、实验室检查、X线改变,并复习相关文献。结果PHOA为一种与遗传有关的疾病,其临床表现呈多样性,与诊断及分型相关的临床表现为骨膜成骨亢进、杵状指(趾)、面部肥厚及脑回样头皮,诊断成立尚须排除继发性因素,并与肢端肥大症、甲状腺性肢端肥厚、类风湿关节炎等相鉴别。结论PHOA在国内外是一种罕见的疾病,应提高对PHOA的认识,以免漏诊或误诊,并给予非甾体抗炎药对症治疗。

重组子宫内膜抗原制备及其在蛋白芯片检测中的应用

目的探索一种纯度高、简便、低成本制备抗子宫内膜抗原的系统和便捷的检测方法。方法通过YK537大肠杆菌表达系统制备人重组子宫内膜抗原蛋白。获得蛋白制备蛋白芯片,利用蛋白芯片方法和酶联免疫吸附法(ELISA)方法检测71例不孕患者抗子宫内膜抗体。结果重组子宫内膜蛋白基因序列克隆入表达载体phoA下游并在大肠杆菌中成功表达。SDS-PAGE和HPLC的结果显示重组子宫内膜抗原蛋白纯度大于95%。通过蛋白芯片和ELISA检测显示蛋白芯片和传统ELISA方法的受试者工作特征曲线(ROC曲线)显示结果一致,曲线下面积为0.89。结论新设计的重组子宫内膜抗原蛋白能在大肠杆菌分泌表达系统简便、高效地表达,将获得的新抗原用于蛋白芯片,操作简便,结果可信,有望成为临床检测抗子宫内膜抗体的手段。

胰高血糖素在大肠杆菌中的分泌表达

报道了用基因工程方法构建含phoA(碱性磷酸酯酶)启动子、phoA信号肽与胰高血糖素基因的表达载体pAGluT. 实验证明, 转化了pAGluT的大肠杆菌(E.coli YK537)可高水平地分泌表达胰高血糖素, 其表达量为80 mg/L. phoA表达系统分泌表达的胰高血糖素的物化性质与天然胰高血糖素相同, 并具有相同的生物活性. 这一结果不仅为基因工程生产胰高血糖素打下基础, 亦为研制胰高血糖素的拮抗剂以及其他多肽的基因工程研究提供了新的思路.

Secretion expression of recombinant glucagon in Escherichia coli

A novel approach for the preparation of recombinant human glucagon was described. An expression vector pAGluT, containing phoA promoter, phoA signal peptide and glucagon gene, was constructed by means of genetic engineering. Escherichia coli strain YK537 was transformed with pAGluT. High-level secretory expression of recombinant human glucagon was achieved. The expression yield of recombinant human glucagon was found to be 80 mg/L, approximately 30% of the total proteins in supernatant. The biological activities and the physicochemical properties of the purified recombinant human glucagon were found to be the same as that of native glucagon. In addition, our results suggested that phoA expression system may be suitable for the expression of other small peptides.