利用基因芯片筛选禽致病性大肠杆菌中与phoP/Q二元调控系统相关的耐药基因

为筛选禽致病性大肠杆菌(APEC)中与phoP/Q二元调控系统相关的耐药基因表达谱情况并对耐药相关基因进行分析,本实验采用基因芯片技术对APEC野生株和△phoP/Q基因缺失突变株进行转录组的差异性比较,结果检测到713个差异表达基因,其中403个基因的表达水平上调,310个基因的表达水平下调。这些基因涉及生物过程、细胞组分、蛋白质分类及调控通路等功能,本研究着重从上述差异基因中筛选出了aphA、parE等耐药相关的功能基因。本研究对phoP/Q二元调控系统与APEC耐药调控的相关性进行了探索与分析,为进一步深入探寻APEC耐药性的调控机制提供了新的切入点与研究靶标。

phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌的毒力调控作用

phoP/Q作为一种外在环境感受器,参与调节细菌对外部环境的适应性。本研究拟探讨phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)的生长、定植、毒力等生物学特性的影响。利用Red重组系统构建APEC AE 17株的phoP/Q双组分调控系统缺失株,并构建phoP/Q双组分调控系统回复质粒,转化缺失株,构建回复株。通过生长运动性试验、黏附入侵CEF细胞试验、毒力基因转录水平检测以及半数致死量(LD50)等试验比较野生株、缺失株、回复株的生物特性。与野生株相比,phoP-phoQ缺失不改变其生长特性;运动性较野生株下降63%;黏附与入侵CEF细胞能力分别降低69.83%(P<0.01)和62.17%(P<0.05);LD50显示毒力减弱13.3倍;polA、tsh基因转录水平分别上调41%、54%;sodA、iss分别下调64%和98%。phoP/Q双组分系统参与对APEC致病性的调控,该系统的缺失会降低APEC的致病性。

禽致病性大肠杆菌双组分系统phoP/Q对鞭毛Ⅲ型分泌系统基因的调控预测

本研究旨在探究禽致病性大肠杆菌(APEC)中双组分系统phoP/Q与鞭毛Ⅲ型分泌系统(鞭毛T3SS)蛋白之间的联系。运用软件进行功能分析,预测phoP/Q与鞭毛T3SS的关系,利用基因芯片技术对APEC野生株和ΔphoP/Q缺失突变株进行转录组的差异性比较,筛选鞭毛T3SS基座中变化较大基因,并用荧光定量PCR检测基因表达变化量。结果显示:经STRING预测发现phoP/Q可能通过调控鞭毛T3SS基因座附近的双组分系统来间接调控鞭毛T3SS。基因芯片筛选与荧光定量PCR检测发现phoP/Q缺失能使鞭毛T3SS核心组件的大部分基因表达差异显著,同时也影响了双组分中motA、motB与cheY的表达。本研究对phoP/Q双组分系统与鞭毛T3SS的关系进行了预测与探索,为进一步研究揭示细菌的活动与致病机制提供了新的切入点与研究方向。

禽致病性大肠埃希菌及其PhoP/Q缺失株对鸡小肠内AvBD6的诱导表达

【目的】分析雏鸡感染禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)及其PhoP/Q缺失株后β-防御素6(AvBD6)在小肠内的分布和表达规律。【方法】将14日龄雏鸡随机分为对照组、APEC攻毒组和PhoP/Q缺失株攻毒组,其中对照组雏鸡腿肌注射生理盐水0.5mL/只,APEC和PhoP/Q缺失株攻毒组雏鸡腿肌分别接种相同剂量1×106 CFU/mL的菌液,分别于攻毒后0,6,12,24,36和48h采集各组鸡小肠样品,用荧光定量PCR(FQPCR)方法对各组织内AvBD6mRNA的表达量进行检测,同时采用免疫组化(IHC)技术对AvBD6蛋白分布进行观察。【结果】FQ-PCR结果显示,感染后24~48h,APEC攻毒组雏鸡十二指肠、空肠、回肠的AvBD6mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05),于48h达到峰值且显著高于0h(P<0.05);在同一时间下,PhoP/Q缺失株攻毒组AvBD6mRNA的表达量显著高于APEC攻毒组(P<0.05)。IHC结果显示,AvBD6主要分布于各小肠段的绒毛上皮细胞和肠腺部分。【结论】APEC能够诱导雏鸡肠道内AvBD6的表达,且PhoP/Q可能参与APEC调控AvBD6的抗感染作用。

禽致病性大肠杆菌phoP/Q基因缺失对雏鸡脾脏microRNAs功能的影响

从microRNA(miRNA)水平探究禽致病性大肠杆菌(APEC)phoP/Q基因缺失对雏鸡脾脏功能表达的影响,为APEC的防制提供参考资料。用禽致病性大肠杆菌和其phoP/Q基因的缺失株分别攻毒14日龄雏鸡,采集其脾脏组织为材料进行高通量测序获得miRNA表达谱,选择差异倍数大于8的miRNA进行Real-time PCR,对差异表达的miRNA进行靶基因预测以及GO、KEGG富集分析。测序结果获得10个差异表达的miRNA,其中1个miRNA表达量下调,9个miRNA表达量上调,Real-time PCR结果表明,miRNA变化趋势与测序结果一致,GO分析结果表明,差异表达基因主要富集在能量代谢、免疫系统、细胞生长与凋亡、糖合成与代谢等生物学过程。KEGG分析结果显示预测靶基因参与MAPK信号通路、糖代谢通路、Wnt信号通路等重要通路。本试验分析禽致病性大肠杆菌phoP/Q基因缺失后感染雏鸡脾脏miRNA的表达差异,从miRNA水平探讨了phoP/Q基因缺失对APEC致病性的影响,为APEC的防治提供参考资料。

禽致病性大肠杆菌phoP/phoQ基因敲除株的构建及其毒力基因转录调控的研究

为研究Pho P/Q二元调控系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)致病性的调控作用,本研究采用Red同源重组技术分别构建了APEC AE17株的pho P基因敲除株AE18和pho Q基因敲除株AE19,并通过p STV-28质粒分别构建pho P和pho Q基因回补株CAE18和CAE19。并对这些菌株的运动能力、对鸡胚成纤维细胞(CEF)的黏附和侵入能力以及其13个毒力基因的转录水平进行了检测。结果表明,pho P和pho Q基因敲除株运动性能力分别为AE17的70.92%和83.83%;黏附和侵入CEF细胞的能力比AE17均极显著降低,分别为AE17的63.11%、65.42%和59.83%、57.82%。荧光定量PCR结果显示,AE18的毒力基因(sod A、pol A和iss)和AE19的毒力基因(fim C和iss)比AE17相应的毒力基因m RNA的转录水平均呈极显著下降(p<0.01)。此外,回补株CAE18和CAE19株能够部分恢复运动性能力、黏附和侵入CEF细胞的能力及相关毒力基因的转录水平。结果表明pho P和pho Q基因的敲除均能够显著改变APEC AE17株相关的生物学特性,并且能够调控毒力基因的转录水平,使其毒力显著下降。本研究为进一步了解APEC的Pho P/Q二元调控系统对其致病性影响提供实验依据。