结核分支杆菌phoS2重组质粒的构建、表达、纯化及生物信息学预测

目的构建结核分支杆菌phoS2表达重组质粒、原核表达及纯化重组蛋白，并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法将目的基因亚克隆到pET32a表达载体，成功构建的重组质粒双酶切鉴定并测序。加IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE鉴定后用含Ni^2＋的His-bind树脂柱亲和层析纯化phoS2，并用Westernblot对其进行鉴定。应用DNAstar等生物分析软件对该蛋白的理化特性、跨膜区域、二级结构、三维结构进行预测。结果双酶切鉴定及测序分析表明，成功构建了基因工程菌株高效表达质粒phos2／pET32a。IPTG诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果显示，上清液中只见极少量的特异蛋白表达带，沉淀部分可见明显的特异表达带，说明phoS2主要是包涵体表达。经免疫印迹分析获得的phoS2分子质量为37953ku。生物信息学预测该蛋白分子质量为37953．1ku，理论等电点为5．75，具有1个跨膜区，位于1-19位，结构域位于1-370位。结论成功构建了结核分支杆菌phoS2／pET32a重组质粒，phoS2能够高效表达。蛋白结构功能的预测对本实验的实施及进一步的研究提供了理论依据。

结核分枝杆菌phoS2基因的克隆及序列分析

目的扩增结核分枝杆菌phoS2基因,并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌phoS2抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌phoS2抗原基因,测序表明该片段开放阅读框为927bp,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为81%,推导编码氨基酸序列同源性为87%。结论成功克隆phoS2基因,为结核病原核表达及相关研究奠定了基础。

结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21(DE3)plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化。结论成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达。

pho2突变体矿质元素含量及耐盐性分析

【目的】PHO2是磷信号通路中重要的调控因子,PHO2突变会造成植物过量的磷累积。尽管已对PHO2进行了大量研究,但始终聚焦于磷元素的积累上,PHO2是否对其他元素的积累有影响尚不清楚。【方法】本研究首先利用水稻日本晴T-DNA插入突变体ospho2,研究在该突变背景下矿质元素在植株体内累积的情况。因Na在水稻和高粱pho2突变体种子中大量累积,利用水稻和高粱pho2突变体同时进行种子萌发期耐盐胁迫实验。【结果】分析野生型日本晴和ospho2突变体在成熟期时地上部和种子中大量元素和微量元素的含量,表明在地上部中ospho2突变体植株中不仅超量累积了磷元素,还累积了诸如钾、镁、锰等元素;在ospho2突变体种子中也过量累积了磷元素,但是累积程度远不如地上部分,其他元素钾、镁、钠、钙和锌等也都有一定的累积。盐胁迫下水稻和高粱pho2突变体萌发期的芽苗率较野生型显著降低。【结论】OsPHO2的突变不仅导致磷的超量累积,对其他很多元素的积累也有较大的影响。水稻和高粱pho2突变体降低了种子萌发期耐盐性。

香蕉淀粉磷酸化酶基因MaPho2的克隆及表达分析

本研究以巴西蕉(Musa acuminata AAA group cv.Brazil)果实为材料,克隆到一个CDS序列长度为2517 kb的MaPho2基因,其编码838个氨基酸,分子量为95.096 kD,等电点为6.09,具有糖原磷酸化酶保守结构域(29~832氨基酸),属于GT35基因家族蛋白。氨基酸序列比对及聚类分析发现,MaPho2与水稻等11种植物Pho2蛋白序列的同源性为77.60%~81.41%,与拟南芥、番茄、马铃薯和辣椒亲缘关系较近,属于胞质型淀粉磷酸化酶。实时荧光定量PCR结果(RT-qPCR)表明,MaPho2基因具有时空表达特异性,在果肉和球茎中高表达,根、叶等组织中表达量较低;在果实发育的后期该基因高表达;但随着果实采后成熟,MaPho2呈现明显上调趋势,在成熟度5时表达量达到高峰。本实验通过MaPho2基因生物信息学和表达模式分析,为后续研究Pho2在果实淀粉降解代谢中的功能提供了理论基础。