油菜黑胫病菌Leptosphaeria biglobosa生物学特性研究

为了解我国油菜黑胫病病原菌(Leptosphaeria biglobosa)的生物学特性,在实验室里研究了温度、pH值、光照、碳源及氮源等条件对该病菌营养生长及分生孢子产生的影响。结果表明:病原菌在5℃～35℃均可进行营养生长并产孢,最适生长和产孢温度为25℃;在pH4～10的范围内该菌均能生长并产孢,在pH7的条件下生长最快,产孢最多。光暗交替有利于菌丝生长和产孢,而持续光照不利于菌丝生长,尤其不利于产孢。最适的碳源、氮源分别是可溶性淀粉、牛肉膏。分生孢子的致死温度为52℃。

ISSR标记分析油菜黑胫病原菌遗传多样性

利用ISSR分子标记技术分析了油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）的遗传多样性。分离获得国内菌株84株，并以15株国外（英国、加拿大、波兰）油菜黑胫病菌菌株作为参照，利用筛选出的24条引物对这99株病原菌进行ISSR—PCR扩增。共扩增出245条带，遗传相似性系数为0．65～1．00，国内和国外油菜黑胫病菌菌株很明显被分为两个菌群，中国84株菌基本按地理来源分为5个类群，只有江苏省菌株分布于各个类群。各省的Nei’s基因多样性指数范围是0．1081～0．2527，而香农（Shannon’S）信息指数的范围是0．1575～0．3726，顺序为江苏〉湖北〉安徽〉内蒙古〉上海〉四川。中国与英国和加拿大菌株的遗传一致度分别为0．8343和0．7839。

中国油菜对黑胫病的抗性评价及抗病基因推导研究

为掌握中国油菜品种的黑胫病抗性水平，为抗病育种及品种合理布局提供理论依据。在室内采用子叶穿刺接种法，对35个油菜品种开展了黑胫病的抗性评价及抗病基因推导研究。供试品种中没有发现对病原菌 Lepto-sphaeria maculans 和 Leptosphaeria biglobosa 表现高抗或免疫的品种，只有3个品种可以兼抗 Leptosphaeria maculans 和Leptosphaeria biglobosa，但均表现低抗。供试的35个品种对12个菌株共产生了17种反应型，其中12个品种的反应型与鉴别寄主的完全相同，18个品种的反应型与鉴别寄主的非常相近，5个品种的反应型不同于任何鉴别寄主。抗病基因推导，已知的12个黑胫病抗性基因 Rlm1～9，Lep R1～3多数以基因组合的形式分布在我国的30个品种中，这些主栽品种可能含有已知的或新的抗病基因。说明现有的油菜种质资源中可能蕴藏着对改良黑胫病抗性具有潜在应用价值的基因资源。

油菜黑胫病的病原、病害循环及其传播危害

油菜黑胫病(Phoma stem canker),其病原由强弱两种致病菌(Leptosphaeria maculans/biglobosa)组成。目前,除中国和印度外,Leptosphaeria maculans已是严重制约世界各国油菜产业发展的重要因素,在各大主产区均已造成了严重的经济损失。在中国,油菜黑胫病的发生危害亦呈扩展蔓延趋势,自1999年首次分离鉴定出黑胫病弱致病性病原菌Leptosphaeria biglobosa后,随后短短的十几年,Leptosphaeria biglobosa的发生危害由部分省市扩展到了14个省的42个市(县)。目前,由于Leptosphaeria biglobosa未对我国的油菜造成明显的损失,故而人们没有足够的重视。而其在世界各国的发生危害、扩散蔓延及演化规律显示,Leptosphaeria biglobosa可逐渐被Leptosphaeria maculanske所取代,即Leptosphaeria maculans对我国的油菜及十字花科作物生产构成了威胁。

油菜黑胫病菌和茎基溃疡病菌的LAMP检测方法的建立

油菜黑胫病和油菜茎基溃疡病分别由子囊菌Leptosphaeria biglobosa和L.maculans引起。我国油菜产区仅发现L.biglobosa,未发现L.maculans。因而,L.maculans是我国的对外检疫性对象。这两种真菌形态相似,引起的病害症状相似,给田间快速准确鉴定带来难度。本研究基于环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP),建立了快速检测L.biglobosa和L.maculans的方法。根据ITS-rDNA序列设计了5条检测L.biglobosa的LAMP引物和6条检测L.maculans的LAMP引物,检测L.biglobosa和L.maculans的最适温度为65℃,反应时间分别为40 min和50 min。两组引物检测特异性高,检测的模板DNA极限达到fg级,与常规PCR检测相比,LAMP检测L.biglobosa和L.maculans灵敏度分别提高了100倍和1000倍。在病害样品实际检测中,采用两种LAMP体系,分别检测了9株罹病油菜茎秆中的病原菌。结果表明:所有茎秆中的病原菌均为L.biglobosa,没有检测到L.maculans,与特异性PCR检测结果一致。本研究建立的LAMP检测方法为快速高通量检测L.biglobosa和L.maculans奠定了基础。