热处理对转基因秸秆中重组蛋白和重组DNA的降解作用

随着转基因作物种植面积的不断扩大,如何高效处理转基因秸秆成为了一个重要的科学问题。未经处理的转基因秸秆中的重组蛋白和重组DNA可以在土壤中存在很长时间,并对土壤生物多样性产生潜在负面影响。因此寻找一个既节约成本又对环境无害的秸秆处理方法非常重要。高温处理是降解转基因秸秆重组蛋白和重组DNA的有效手段,但目前对处理温度和处理时间的选择还缺乏系统的研究。本研究通过试纸条、聚合酶链反应(PCR)等方法检测不同温度和时间处理的转基因作物秸秆中重组蛋白和重组DNA的水平。结果表明,转基因大豆、棉花、玉米、水稻的秸秆在50℃处理3 h后,其体内的抗除草剂蛋白草胺膦乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase, PAT)等重组蛋白基本降解;但相同温度下,重组DNA的降解则需要4 d时间;提高处理温度可以在一定程度上缩短重组蛋白和重组DNA降解所需的时间。50℃处理4 d的条件在实际生产中通过堆肥就能实现。本研究从分子生物学的角度为转基因秸秆处理提供了依据。

抗除草剂Bar基因的优化及PAT蛋白的表达

利用生物信息学方法优化了适用于原核表达的Bar基因序列密码子,克隆了Bar基因序列并构建了p ET28a-Bar融合表达载体,并转入大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)。结果表明,融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式表达膦丝菌素乙酰转移酶(PAT蛋白质),并通过镍离子亲和层析纯化后获得了PAT蛋白质,该纯化蛋白质的获得为利用酶联免疫法定量检测和筛选转基因植物提供了必要前提。

膦丝菌素乙酰转移酶的表达及单克隆抗体制备

目的表达有生物活性的膦丝菌素乙酰转移酶(PAT),制备PAT蛋白单克隆抗体(mAb)。方法通过PCR克隆bar基因编码区全长,将bar基因与原核表达载体pET28a(+)连接,构建重组质粒pET28-bar并转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经IPTG诱导目的蛋白表达,利用镍离子亲和层析纯化PAT蛋白,分析PAT蛋白活性。免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾脏与Sp2/0细胞融合,经间接ELISA筛选分泌抗PAT蛋白抗体杂交瘤细胞。结果在大肠杆菌中以可溶形式表达出重组PAT蛋白,纯化的重组PAT蛋白具有乙酰转移酶活性,制备了9株抗PAT蛋白mAb。结论表达的PAT蛋白可以用于除草剂解除剂研究,制备的mAb可能用于转基因产品的检测研究。

多壁碳纳米管/纳米Ag-TiO_2膜DNA电化学生物传感器

基于多壁碳纳米管/纳米Ag-TiO2复合膜制备了高灵敏度的DNA电化学生物传感器。将Ag-TiO2复合物与适量分散于N,N-二甲基甲酰胺中的多壁碳纳米管(MWNT)相混合,形成均匀稳定的混合溶液,将其滴涂于裸碳糊电极表面,制得MWNT/Ag-TiO2修饰碳糊电极。碳纳米管大的比表面积和良好的电子传递性能与Ag-TiO2纳米复合物良好的生物相容性和对DNA极好的吸附能力的协同作用,显著提高了DNA探针的固载和DNA杂交的检测灵敏度。应用循环伏安法和电化学交流阻抗谱分别对传感膜的制备和DNA的固定与杂交进行了表征。以电化学交流阻抗谱法对转基因植物外源草丁膦乙酰转移酶基因片段进行了检测,线性范围为1.0×10-11～1.0×10-6mol/L,检出限为3.12×10-12mol/L。

以还原氧化石墨烯和纳米二氧化锆为DNA探针固定平台电化学测定转基因玉米中特定基因序列（英文）

草胺膦乙酰转移酶基因(PAT)是一种转基因植物的外源DNA片段。本文以还原氧化石墨烯和纳米二氧化锆(nanoZrO2)的复合物作为固定DNA探针的平台,建立了一种灵敏地检测PAT基因的方法。首先,氧化石墨烯直接在电极表面进行电化学还原,然后将一层nanoZrO2涂覆于其表面,利用DNA中的磷酸基团与nanoZrO2中氧的亲和作用固定DNA探针。通过微分脉冲伏安法检测DNA探针与PAT基因片段的杂交,构建了用于检测PAT基因片段的电化学生物传感器。该传感器具有稳定性好,重复性好的特点,可灵敏地检测转基因玉米中的PAT基因,检测限达2.0×10^-15mol/L。