微小RNA-499对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的探究微小RNA-499(miR-499)在非缺血性心衰中对心肌细胞凋亡的影响。方法构建快速起搏致心衰大鼠,然后构建miR-499腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体并将其转染入大鼠体内,通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)使miR-499在大鼠体内的表达上调,用qRT-PCR检测大鼠体内miR-499的表达水平,用Western blot检测大鼠心衰模型中PDCD4和PACS2的含量,用免疫组化及TUNEL法检测心肌细胞凋亡程度。结果快速起搏致心衰大鼠模型建立成功,构建rno-miR-499腺相关病毒载体并将其转染入使大鼠模型体内miR-499表达上调,结果表明与假手术组相比,起搏组动物左心室射血分数(81.8%±2.4%vs 64.3%±2.2%,P <0.05)及左心室短轴缩短率(44.7%±2.4%vs 29.1%±0.9%,P <0.05)明显下降,而自主心率、心脏质量和左心室舒张末压明显上升。与单纯起搏组相比,miR-499过表达可使大鼠心衰模型自主心率下降[(441.6±22)/min vs (368.4±27)/min,P <0.05],左心室舒张末压降低[(34.8±11.4) mmHg vs (19.4±10.3) mmHg,P <0.05](1 mmHg=0.133 kPa)。心肌组织中程序性细胞凋亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)和PACS2蛋白的表达明显降低。快速起搏刺激可致大鼠心脏出现结构重构,心肌组织的凋亡程度增加,但miR-499的过表达则使其程度减小。结论 MiR-499可降低PDCD4和PACS2的表达,抑制快速起搏所致心衰大鼠心肌细胞的凋亡。

PACS-2在阿尔茨海默病发展中作用机制研究

目的探究磷酸呋喃酸性簇分选蛋白-2(phosphofurin acidic cluster sorting protein-2,PACS-2)在N2a/APP695swe细胞线粒体功能及细胞凋亡中的参与作用,进一步探讨PACS-2在阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)发生、发展中的作用及意义。方法CCK8法分析不同浓度的二苯乙烯苷(tetrahydroxy stilbeneglycoside,TSG)处理N2a/APP695swe细胞48h后的细胞存活率,选择合适浓度的TSG用于后续实验。体外常规培养N2a/WT细胞和N2a/APP695swe细胞,实验细胞分为3个组:空白对照组(WT组):N2a/WT细胞;模型组(APP组):N2a/APP695swe细胞;治疗组(TSG组):N2a/APP695swe细胞,合适浓度的TSG干预。TUNEL法荧光显微镜观察细胞凋亡情况,JC-1法流式检测细胞线粒体膜电位,Westernblot(WB)检测PACS-2的蛋白表达情况,RT-qPCR检测PACS-2的mRNA表达情况。结果CCK8法分析不同浓度的TSG作用细胞48h后的细胞存活率:100μmol/L的TSG保护作用最显著,差异有统计学意义(P<0.01);TUNEL法荧光显微镜观察细胞凋亡情况,与WT组相比,APP组的凋亡率升高,与APP组相比,TSG组的凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05);JC-1法检测细胞线粒体膜电位;与WT组相比,APP组的膜电位降低,与APP组相比,TSG组膜电位升高,差异有统计学意义(P<0.05);WB检测PACS-2的蛋白表达:与WT组相比,APP组的PACS-2表达升高,与APP组相比,TSG组的PACS-2表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);RT-qPCR检测PACS-2的mRNA表达:与WT组相比,APP组的PACS-2表达升高,与APP组相比,TSG组的PACS-2表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PACS-2在AD的发生、发展中有重要作用,其上调可能促进AD的发生,脑保护药物TSG可能通过下调PACS-2抑制AD模型细胞凋亡并改善线粒体功能发挥细胞保护作用。

酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-1的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:原核表达和纯化PACS-1,并制备其多克隆抗体。方法:通过RT-PCR扩增出PACS-1的编码基因,测序正确后克隆入原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导PACS-1与GST融合蛋白的表达并经Glu-tathione Sepharose 4B纯化;经SDS-PAGE和Western blot鉴定,应用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价。结果:表达和纯化了PACS-1,并获得了较高效价的抗血清。结论:获得纯化的PACS-1及其多克隆抗体,为进一步研究PACS-1的功能奠定了基础。

磷酸弗林酸性簇分选蛋白2对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大的影响及其机制

目的探究磷酸弗林酸性簇分选蛋白2(PACS-2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌肥大的影响及其机制。方法剪取并消化出生1~2 d的SD大鼠乳鼠的心脏组织,采用差速贴壁法获取乳鼠心肌细胞(NRCMs),原代培养24 h。以浓度为1.5μmol/L的AngⅡ处理NRCMs 0、3、6、12、24 h,采用Western blot方法检测细胞中FUN14域蛋白1(FUNDC1)、PACS-2、三磷酸肌醇受体蛋白(IP3R)的表达水平,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测细胞中心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA的表达水平。将NRCMs分为A~C组,A组使用无血清培养基培养,B、C组分别转染si-NC和si-PACS-2,采用Western blot方法检测各组细胞中PACS-2蛋白的表达水平。将NRCMs分为D~G组,D组使用无血清培养基培养,E组以浓度0.15μmol/L的AngⅡ培养,F、G组分别转染si-NC、si-PACS-2后再以浓度0.15μmol/L的AngⅡ培养,采用TRITC-鬼笔环肽染色技术检测各组心肌细胞表面积,RT-qPCR检测各组细胞ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平,以Fluo-4,AM探针检测各组细胞胞质Ca^(2+)的水平。将NRCMs分为H~K组,H组使用无血清培养基培养,I、J组分别转染si-NC、si-PACS-2,K组转染si-PACS-2并且以浓度1μmol/L的钙调蛋白(CaM)拮抗剂处理后,采用RT-qPCR方法检测各组细胞ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平。结果以浓度1.5μmol/L的AngⅡ处理NRCMs 0、3、6、12、24 h,NRCMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平呈时间依赖性上调(F=25.73~58.30,P<0.05),并且处理第24小时时相较于第0小时时均显著上调(t=5.35~37.50,P<0.05)。以浓度1.5μmol/L的AngⅡ处理NRCMs 0、3、6、12、24 h,NRCMs中IP3R、PACS-2以及FUNDC1蛋白的表达水平均呈时间依赖性下调(F=5.37~9.07,P<0.05),并且处理第24小时时相较于第0小时时显著下调(t=6.55~7.42,P<0.05)。与B组相比,C组NRCMs中PACS-2蛋白的表达水平显著下调(t=5.92,P<0.05)。与F组相比,G组NRCMs中心肌细胞表面积增大,ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平及胞质Ca^(2+)水平均上调(t=3.50~26.60,P<0.05)。与J组相比,K组NRCMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA表达水平均显著下调(t=3.27~5.13,P<0.05)。结论敲低PACS-2可增加NRCMs中胞质Ca^(^(2+))水平,并且可能以Ca^(^(2+))-CaM依赖的方式加重AngⅡ诱导的心肌肥大的发生。

微小RNA-6791-5p靶向磷酸呋喃酸性簇分选蛋白2抑制结直肠癌增殖、迁移和侵袭

目的探讨微小RNA(miR)-6791-5p对人结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响及其分子机制。方法采集培养人结直肠癌细胞系RKO、SW480、DLD1、HCT116以及人正常结肠上皮细胞NCM460。通过反转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-6791-5p在各细胞系中的表达水平(表达倍数为0.52±0.04、0.83±0.06、0.60±0.12、0.68±0.07),并构建miR-6791-5p模拟物(miR-6791-5p mimic)及其阴性对照Negative control,并将其转染至RKO细胞。使用RT-qPCR检测miR-6791-5p和PACS2 mRNA的表达水平(表达倍数为0.468±0.032)。利用蛋白质印迹法(Western blot)检测PACS2蛋白的表达水平[RKO:(51.590±6.018)%]。使用两样本t检验进行统计分析,结果以均数±标准差(±s)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。结果miR-6791-5p在人结直肠癌细胞系表达水平显著低于人结肠上皮细胞,其中RKO和DLD1下调最明显(RKO组低于460组:0.52±0.04比1.00、DLD1组低于460组0.60±0.12比1.00),差异有统计学意义(RKO:t=17.811,P<0.0001;DLD1:t=5.372,P<0.01)。RKO转染后,mimic组miR-6791-5p表达水平高于mimic NC组(3.28±0.44比1.00),差异有统计学意义(RKO:t=8.764,P<0.01)。细胞计数试剂(CCK-8)检测表明mimic组24、48、72、96 h细胞吸光度值显著低于mimic NC组(24 h吸光度值为0.185±0.004比0.250±0.030,48 h吸光度值为0.275±0.040比0.376±0.020,72 h吸光度值为0.497±0.120比0.657±0.010,96 h吸光度值为0.691±0.004比0.905±0.019),差异有统计学意义(RKO:t=10.821,P<0.01)。平板克隆实验表明mimic组集落形成数低于mimic NC组(115.70±12.51比176.00±19.18),差异有统计学意义(RKO:t=4.581,P<0.05)。划痕愈合实验显示miR-6791-5p mimic组划痕愈合率低于NC组[(14.960±0.848)%比(36.480±1.340)%],差异有统计学意义(t=23.491,P<0.0001)。Transwell迁徙和侵袭实验显示穿透微孔膜的细胞数mimic组低于mimic NC组(迁移数目miR-6791-5p mimic组比NC组42.330±3.512比125.700±7.760,侵袭数目分别为54.33±4.16比159.30±7.76),差异有统计学意义(Transwell迁移t=16.931,P<0.01)、(Transwell侵袭t=20.641,P<0.01)。在线靶预测软件(miRWalk、mirtarbase、targetscan)预测miR-6791-5p可能的靶基因,并通过qRT-PCR及Western blot验证,mimic组PACS2的mRNA及蛋白表达水平低于mimic NC组[比例为(51.590±6.018)%比1.00],差异有统计学意义[mRNA(RKO:t=27.951,P<0.0001);Western blot(RKO:t=13.931,P<0.001)]。结论miR-6791-5p在结直肠癌细胞中低表达,过表达miR-6791-5p能抑制结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,并且明显下调PACS2的mRNA和蛋白表达水平,说明miR-6791-5p可能通过PACS2调控结直肠癌增殖、迁移及侵袭能力。

蠕虫来源的LNFPⅢ对周围性神经病理性疼痛的病理发生和脊髓胶质细胞活化的影响

目的 探讨蠕虫来源的免疫调控性糖分子乳-N-岩藻五糖Ⅲ（lacto-N-fucopentaoseⅢ,LNFPⅢ）对成年大鼠胫神经永久性横断伤（即改良型备用性神经损伤,modified spared nerve injury,mSNI）后神经病理性疼痛的病理发生的影响,以及它对此时脊髓胶质细胞活化的影响。方法 成年雄性SD大鼠随机分为4组,即假手术组（n=6）、mSNI手术组（n=6）、mSNI手术＋牛血清白蛋白（BSA）组（n=12）和mSNI手术＋LNFPⅢ组（n=12）。各组动物行右侧mSNI手术或者相应的假手术,根据实验分组腹腔注射BSA或LNFPⅢ与BSA的结合物。每组取6只大鼠进行足底试验、von Frey纤维试验、针刺试验和丙酮试验,测试手术前、后手术同侧和对侧大鼠后爪足底面腓肠神经和隐神经皮肤区域特异性的疼痛反应。制备mSNI手术＋BSA组和mSNI手术＋LNFPⅢ组手术后7d和14d（各组每个时间点3只动物）的第3~第4腰椎（L3~4）脊髓节段冰冻切片,进行小胶质/巨噬细胞标志物分化抗原簇分子11b（cluster of differentiation molecule 11b,CD11b）和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的免疫荧光染色。结果 成年大鼠mSNI后,早期系统性给予LNFPⅢ可显著缓解手术后急性诱导期（4/5d）和慢性转化期（7/8d和14/15d）中手术侧后爪足底面腓肠神经和隐神经皮肤区域特异性的机械和温度刺激诱发的病理性疼痛。同时,早期系统性给予LNFPⅢ抑制mSNI大鼠手术侧脊髓背角中术后7d小胶质/巨噬细胞以及术后7d和14d星形胶质细胞的活化。结论 早期系统性给予LNFPⅢ能抑制成年大鼠mSNI后神经病理性疼痛的病理发生（包括急性诱发和慢性转化）以及该过程中脊髓胶质细胞的活化。