PRPS1 I72位点突变对急性淋巴细胞白血病耐药性的影响及其机制研究

目的·研究磷酸核糖焦磷酸合成酶1(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1,PRPS1)I72位点突变是否能使急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)细胞对巯嘌呤类化学治疗(化疗)药物6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine,6-TG)产生耐药性,并解释其作用机制。方法·将临床上已发现的PRPS1基因的各突变(I72F、R177S、V316L)和2个ALL细胞系(KOPN72bi和RS4;11)中存在的PRPS1基因突变(V208A、V289A)分别插入融合了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的载体pGV303中,用已证明的对巯嘌呤类化疗药耐药的PRPS1 A190T突变为阳性对照,对该类药不耐药的空载体pGV303(Vector)、PRPS1野生型(wild type,WT)及PRPS1 I72V突变为阴性对照。将上述构建好的载体瞬时转染入HEK-293T细胞(简称293T细胞)中,并采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测PRPS1各突变体在293T细胞中的蛋白表达情况。采用药物敏感性实验检测并计算6-MP或6-TG对上述瞬转PRPS1各突变体的293T细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))。随后,除PRPS1 I72F和I72V之外,将第72位异亮氨酸(isoleucine,I)变成其他氨基酸的多个突变即I72M、I72L、I72N、I72S、I72T分别插入载体pGV303中,瞬时转染入293T细胞后采用Western blotting、药物敏感性实验检测各突变体在293T细胞中的蛋白表达情况以及6-MP或6-TG的IC_(50)。采用慢病毒感染法将PRPS1 WT、I72F、I72V、A190T及载体pGV303感染REH细胞系,通过流式细胞术分选GFP阳性细胞以获得PRPS1各突变体稳定表达的细胞,并采用Western blotting及药物敏感性实验检测各突变体在REH细胞中的蛋白表达情况以及6-MP或6-TG的IC_(50),用以验证293T细胞获得的药物敏感性实验结果。采用AnnexinⅤ/DAPI双染法评估各REH细胞系的凋亡情况,并通过Western blotting检测各REH细胞系的DNA损伤相关蛋白[S139位点磷酸化的组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX-S139,γ-H2AX)、磷酸化的细胞周期检验点激酶2(phosphorylated check point kinase 2,pCHK2)]和细胞凋亡相关蛋白聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶剪切体[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase,cleaved PARP]的表达水平。使用PDB数据库(Protein Data Bank)中编号为2HCR(PDB code 2HCR)的PRPS1晶体结构图,通过三维成像及PyMOL软件预测并绘制I72位点、I72V和I72F的氨基酸残基及空间构象图。结果·Western blotting结果显示,瞬时转染的外源性PRPS1各突变蛋白在293T细胞中成功表达;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72F、R177S、V316L、V208A与阳性对照A190T的293T细胞对6-MP或6-TG的IC_(50)均远高于表达V289A及阴性对照Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000)。将第72位异亮氨酸变成其他氨基酸后,Western blotting结果显示瞬时转染的外源性PRPS1 I72位点的各突变蛋白在293T细胞中成功表达;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72M、I72F、I72L、I72N、I72S、I72T与A190T的293T细胞对6-MP或6-TG的IC_(50)均远高于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000)。慢病毒感染REH细胞后,Western blotting结果显示在已构建的稳定细胞系中PRPS1 WT、A190T、I72F、I72V的蛋白高表达且表达量相似;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72F、A190T的REH细胞对6-MP或6-TG的IC_(50)均远高于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000),与293T细胞中瞬时转染得到的药物敏感性结果一致。AnnexinⅤ/DAPI双染法、DNA损伤和凋亡相关蛋白的Western blotting检测的结果均显示,经6-MP处理后,表达PRPS1 A190T、I72F的REH细胞系的DNA损伤和凋亡率明显低于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000)。蛋白结构分析结果显示,PRPS1 I72F会使PRPS1的空间构象发生改变。结论·PRPS1 I72F、R177S、V316L、V208A、I72M、I72L、I72N、I72S、I72T突变可使细胞获得对巯嘌呤类化疗药的耐药性,PRPS1 V289A、I72V突变不影响细胞对巯嘌呤类化疗药的敏感性。293T中的药物敏感性实验结果和REH中的药物敏感性实验结果一致,证明293T细胞可以作为检测PRPS1突变对巯嘌呤类化疗药物耐药性的快速研究模型。PRPS1 I72位点突变对巯嘌呤类化疗药耐药性的影响可能与PRPS1结构发生改变有关。

细胞周期过程中PRPS1调节AMP、IMP与ADP的动力学特性

基于Hill动力学与Michaelis-Menten方程建立理论模型,研究细胞周期信号对核糖磷酸二磷酸激酶1(PRPS1)的调控作用,以及细胞周期过程中PRPS1调节腺苷一磷酸(AMP)、肌苷一磷酸(IMP)与二磷酸腺苷(ADP)的动力学特性.研究发现,在细胞周期过程中,CDK1-Plk1-APC通路信号的周期演化,调控了PRPS1的活性,使得PRPS1的活性呈现出周期演化特性;PRPS1的过表达,会进一步促进三磷酸腺苷(ATP)、IMP和腺苷一磷酸AMP增加,并且,IMP转化为AMP的节奏跟随细胞周期的节律,ADP则会对PRPS1的表达具有一定的抑制作用.通过分析细胞周期调节过程中的时间延迟效应还发现,在时间延迟调控下,CDK1-Plk1-APC信号通路动力学特性的改变,在很大程度上影响ATP、IMP与AMP的动力学特性,进而调控癌细胞的生长增殖.理论结果符合实验,进一步揭示了细胞周期过程中,PRPS1磷酸化诱发癌症的调节机理.

3,5,2',4'-四羟基查尔酮对大鼠尿酸及PC12细胞嘌呤代谢酶的影响

目的研究3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)对高尿酸血症大鼠尿酸的影响及对PC12细胞嘌呤代谢关键酶的影响.方法灌胃给予SD大鼠P40(2.0、4.0和8.0 mg/kg)5次,末次给药前1 h腹腔注射氧嗪酸钾(250mg/kg)诱导成高尿酸血症动物模型,注射后2 h取血,用磷钨酸法测定血尿酸水平及肝尿酸含量.给予PC12细胞系列浓度的P40和阳性对照药别嘌醇后培养48 h,收集细胞提取总RNA,采用逆转录聚合酶链(RT-PCR)的方法,检测嘌呤代谢关键酶HGPRT、PRPS和PRPPAT m RNA的表达水平.结果给予P40 2.0、4.0 mg/kg均能显著降低高尿酸血症大鼠的血尿酸水平,和模型组相比,差异有统计学意义(P<0.01),但对肝尿酸含量没有影响.给予P40 1×10^(-8),1×10^(-7),1×10^(-6) mol/L处理PC12细胞48 h后,对HGPRT、PRPS和PRPPAT基因的m RNA表达没有明显影响,与对照组相比差异无统计学意义(P<0.01).结论在本实验条件下,P40能降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症大鼠的血尿酸水平,对PC12细胞的HGPRT、PRPS和PRPPAT基因的m RNA表达无影响.

大肠杆菌合成烟酰胺单核苷酸途径构建及发酵工艺研究

β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)作为人体内重要辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的直接前体受到了广泛关注,目前工业上主要采用化学法或化学-酶催化法进行合成,发酵法仍未取得突破。为获得一株高产NMN的工程菌株,对大肠杆菌进行了代谢途径改造。首先在大肠杆菌中异源表达了来自松噬几丁质菌(Chitinophaga pinensis)的烟酰胺磷酸核糖转移酶,构建了NMN的补救合成途径;为增强前体5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribose 1-pyrophosphate,PRPP)的供应,过表达了从葡萄糖出发的多个途径酶,促进了葡萄糖向磷酸戊糖途径的流动;同时,为有利于NMN积累,通过敲除NMN下游代谢分解途径基因pncC、ushA以及调控NAD+衍生物基因nadR,所获得的重组菌产量摇瓶水平达到60 mg/L,是初始产量的4.95倍;进一步在5 L罐上进行发酵试验,产量最高达到390.1 mg/L。该菌株用于NMN的发酵生产具有良好的潜力。

3,5,2',4'-四羟基查尔酮对小鼠尿酸及尿酸合成相关酶基因的影响

用氧嗪酸钾诱导高尿酸血症动物模型,对化合物3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)的降尿酸作用及尿酸合成相关酶基因进行研究。用磷钨酸法测定小鼠血清尿酸水平,用RT-PCR测定脑组织中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、肝脏中的磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPS)和磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPPAT)mRNA的表达水平。结果表明:灌胃给予高尿酸血症小鼠P40 2、4、8 mg/kg和阳性对照药别嘌醇1 mg/kg,共给药5次,每天2次,均显著降低血清尿酸水平(P<0.05,0.01),具有显著的降尿酸作用;但对HGPRT、PRPS、PRPPAT的mRNA表达水平无明显影响。

甲氨蝶呤可逆转PRPS1基因突变引起的急性淋巴细胞白血病细胞对6-巯基嘌呤的耐药性

目的 :探讨甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)是否可以逆转磷酸核糖焦磷酸合成酶1(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1,PRPS1)基因突变引起的急性淋巴细胞白血病细胞对6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)的耐药性,并初步探讨其可能的作用机制。方法 :将携带野生型(wide type,WT)PRPS1基因以及A190T或S103T突变型PRPS1基因的重组慢病毒分别感染人急性淋巴细胞白血病Reh细胞以感染空载体GV303作为空白对照),采用细胞活力实验和蛋白质印迹法验证上述细胞系构建成功。分别用MTX和6-MP单药以及MTX+6-MP联合用药处理各细胞系,然后锥虫蓝拒染法和AnnexinⅤ/7-AAD双染法分别检测细胞的增殖和凋亡情况;蛋白质印迹法检测DNA损伤相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达水平;细胞活力实验和液相色谱-质谱联用法分别检测MTX作用各细胞系后,6-MP对细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)、6-MP代谢产物以及次黄嘌呤水平的改变。结果:外源性PRPS1蛋白在Reh细胞中成功过表达,而且与对照组GV303和WT细胞系相比,感染PRPS1突变基因的A190T和S103T细胞系均对6-MP和MTX耐药,差异均具有统计学意义(P值均<0.001)。与MTX和6-MP单药组相比,MTX+6-MP联合用药可以更有效地抑制A190T和S103T细胞的增殖(P值均<0.001),促进细胞凋亡(P<0.01,P<0.001),上调磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX,γH2AX)、磷酸化细胞周期检验点激酶(2phosphorylated checkpoint kinase 2,p-Chk2)及聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]剪切体的表达(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。此外,MTX处理各细胞后,6-MP对A190T和S103T细胞的IC50值远远低于MTX未处理组P值均<0.001),且细胞中次黄嘌呤的水平明显降低(P值均<0.001),而6-MP的代谢产物硫代次黄嘌呤核苷酸(thioinosine monophosphate,TIMP)和硫代鸟嘌呤核苷酸(thioguanosine monophosphate,TGMP)的水平均明显升高(P值均<0.001)。结论 :MTX可以逆转PRPS1基因突变引起的急性淋巴细胞白血病细胞对6-MP的耐药性,其机制可能与其抑制次黄嘌呤的异常积累有关。

离子对反相HPLC测定人红细胞PRPP合成酶活性

Using ion-pair reversed-phase HPLC (IPrHPLC), the PRPP synthetase activity inhuman erythrocytes was estimated. Methodological improvements have been taken on seeral aspects, including the removal of leukocytes and platelets in preparation of hemolysates, lysis of erythrocyte membranes and raising of efficiency in separation of ADP from ATP peaks etc. Thismethod fulfills the requirements of simplicity, reproducibility and accuracy. The intrabatch coefficient of variation was ±3. 0 % on average, the mean relative deviation was 2. 3 %, with a recoveryrate of 94.3—98.6%. The mean value of PRPP sythetase activities in the erythrocytes of 28healthy Chinese was 2. 19 ± 0. 61 μmol·min－1·g－1.

生命物质-D-核糖

简述D-核糖的形成机理,转化途径,作用及药理和部分实验进展情况。

β-烟酰胺单核苷酸的生理活性与合成研究进展

烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)作为辅酶Ⅰ(即NAD+)的关键前体之一,广泛存在于多种生物中,β异构体为其活性形式。研究表明β-NMN在多种生理代谢过程中起关键作用,作为抗衰老、改善退行性疾病和代谢性疾病的潜在活性物质,β-NMN的应用价值被深度发掘,实现规模化生产迫在眉睫。生物合成法因其具有高立体结构选择性、反应条件温和、副产物少等优点,成为合成β-NMN的首选方法。本文综述了β-NMN的生理活性、化学合成法和生物合成法,其中重点介绍生物合成法中涉及到的代谢途径,旨在探索利用合成生物学优化β-NMN生产策略的潜力,为β-NMN的代谢途径研究与高效生产提供理论基础。