鸽Ⅰ型副黏病毒、圆环病毒和疱疹病毒混合感染的诊断

研究旨在确诊广西某肉鸽场中出现神经症状的病鸽并为该场提供相应的防治方案,通过临床诊断、病理解剖、分子生物学检测、细菌分离、病毒分离等方法对广西某肉鸽场病鸽进行诊断。结果显示,剖检可见病鸽肝脾肿大、坏死,花斑肾;分子生物学检测结果显示,鸽Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1)、圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)和疱疹病毒(pigeon herpesvirus,PiHV)为阳性;对病样进行细菌培养,结果未分离到细菌;将病样接种SPF鸡胚进行病毒分离,结果显示,尿囊液血凝效价稳定在8 log2,其血凝性可被新城疫病毒(NDV)阳性血清抑制,但不能被禽流感病毒(AIV)阳性血清抑制。研究表明,最终诊断结果为PPMV-1、PiCV和PiHV混合感染。

鸽副黏病毒Ⅰ型S-1株的分子特性分析

对从上海郊区发病鸽场分离鉴定的鸽副黏病毒Ⅰ型S-1毒株进行分子特性分析,选取融合蛋白F基因片段设计特异性引物,用RT-PCR扩增F基因cDNA片段,并将其克隆到pGEM-T载体中。序列分析结果表明,分离株的F基因片段为1666 bp,包含完整的F基因,编码553个氨基酸,其F蛋白与常见疫苗株B1、La Sota、V4的氨基酸同源性分别为89.2%、89.0%和91.5%;与国内鸽分离株YN P1、ch 98-1和STP96的氨基酸同源性分别为91.2%、93.9%和94.6%;与国外鸽分离株116600、248VB、Capital 397、IT-22782和Tigre 699的同源性分别为95.7%、96.0%、95.1%、99.1%和95.5%。PPMVS-1分离株的F蛋白裂解位点序列为112G-R-Q-K-R-F117,属于基因Ⅵ型中等毒力的鸽Ⅰ型副黏病毒。

鸽Ⅰ型副黏病毒与沙门氏菌、大肠杆菌混合感染的诊断

从珠三角某鸽场病死鸽中无菌操作采取心血、肝脏、脑、脾脏,接种于麦氏培养基和木糖—赖氨酸—脱氧胆酸琼脂培养基,经细菌纯化、镜检、生化试验、PCR检测和药敏试验,结果显示30只病鸽有8只分离到沙门氏菌,阳性率为26.7%;10只分离到大肠杆菌,阳性率为33.3%;其中6只同时分离到沙门氏菌和大肠杆菌,混合感染率为20.0%。经病毒分离培养、PCR检测,结果显示从6个混合样品中分离到5株副黏病毒,分离率为83.3%。结果表明,该鸽场鸽群发生了副黏病毒、沙门氏菌、大肠杆菌混合感染。本试验对珠三角鸽场近年较常发生的、以乳鸽较严重发病死亡的典型疫情作了较明确的诊断。

鸽Ⅰ型禽副粘病毒F基因克隆及序列分析

利用RT－PCR技术获得了编码鸽Ⅰ型禽副粘病毒GD／P1分离株F0裂解位点附近884bp的F基因cDNA片段，并将其克隆到pGEM－TEasy质粒中，获得了重组质粒T－pPWV－F－I，核酸序列测定和分析表明，该片段与新城疫病毒强毒株F48E9和HER／33相应区域的同源性分别为87．5％和88．19％，与新城疫病毒弱毒株LaSota和B1株的同源性分别为83．83％和84．15％．该病毒F0裂解位点的氨基酸序列为Arg－Arg－Gln－Lys－Arg－Phe－Ile－Gly－Ala．这在分子水平上证明该毒株较接近于新城疫病毒强毒。

鸽禽Ⅰ型副粘病毒油佐剂灭活苗对雏鸡免疫效果评价

用鸽 Ａ／ Ｐ Ｍ Ｖ１ 油佐剂灭活苗与 Ｎ Ｄ Ｖ 油佐剂灭活苗分别免疫雏鸡，免疫后２１ ｄ 抗体水平达到峰值，免疫后４２ ｄ 用新城疫强毒对两种疫苗免疫鸡分别进行攻击，鸽 Ａ／ Ｐ Ｍ Ｖ１ 油佐剂灭活苗免疫组保护率为７３．３３％ ， Ｎ Ｄ Ｖ 油佐剂灭活苗免疫组保护率为９９．６７％ 。

不同禽源的禽Ⅰ型副黏病毒株毒力、免疫原性及抗原相关性研究

从病死的鸡、鹅、鸽中分离到3株禽I型副黏病毒(CPMV、GPMV、PPMV)。毒力测定结果显示,CPMV、GPMV的毒力与鸡新城疫病毒(NDV)F48E9株的毒力相似,为强毒型;PPMV的毒力与鸡NDVLaSota株的毒力相似,为自然弱毒株。对该分离株F基因裂解位点的序列分析结果表明,CPMV、GPMVF裂解位点氨基酸序列为112K-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的序列特征;PPMV F裂解位点氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,属于弱毒株的特征性序列。将该3株病毒制成灭活疫苗,分别免疫鸡,结果都能诱导鸡体产生较高水平的HI抗体;再分别以CPMV、GPMV攻击免疫鸡群,结果显示免疫鸡群可得到保护,而非免疫鸡群被攻击后全部致死。用HI方法检测3株病毒与Lasota株之间的交叉血凝抑制试验,结果表明LaSota与GPMV两毒株间的抗原性无明显差异,LaSota与CPMV、PPMV两毒株间的抗原性有较小的差异。本研究将有助于进一步开展禽Ⅰ型副黏病毒的致病机制和新型疫苗等方面的研究。

一株鸭源禽Ⅰ型副黏病毒毒力测定及诱导免疫应答研究

试验旨在测定一株从番鸭中分离获得的禽Ⅰ型副黏病毒(GSFY株)的生物学特性和遗传特性,并将其制成油乳剂灭活疫苗,进行番鸭免疫保护试验。结果显示,GSFY株的平均致死时间(mean death time,MDT)为71h,脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI)为1.75,静脉接种致病指数(intravenous pathogenicity index,IVPI)为2.49;GSFY株F基因核苷酸序列同源性分析显示,其与鸡源Chicken/China/Guangxi 9/2003株同源性最高,为97.1%,且二者均处于基因Ⅶ型分支,综合以上结果确定其为禽Ⅰ型副黏病毒基因Ⅶ型强毒株。免疫保护试验结果显示,疫苗进行3次免疫后对番鸭有良好的免疫保护效果,3次免疫后第7天抗体效价平均值达到6log2,第21天抗体效价平均值达到8log2,用GSFY毒株攻击免疫番鸭,当抗体滴度>5log2时,保护率达100%。本研究结果为生产实践制订鸭预防禽Ⅰ型副黏病毒病的免疫程序提供参考。

鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)的田间试验

为验证鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)对鸽子的安全性和免疫效果,对试制的5批鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)分别在3家规模化养鸽场进行田间试验。结果表明:幼龄鸽、青年鸽和种鸽免疫鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)后均无任何不良反应,并产生了较高的抗体水平,免疫后180 d对鸽副黏病毒Ⅰ型强毒川沙株的攻毒保护率在90%以上。试验效果证明,鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)安全有效。

鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)的分离与鉴定

利用SPF鸡胚培养法从上海川沙某具有典型新城疫症状和病理变化的高死亡率发病鸽场的死亡鸽体内分离到一株病毒。对该病毒E5代尿囊液进行病原学鉴定、RT-PCR鉴定、理化特性测定、致病指数、病毒血清学试验及鸽体致病性试验,结果显示该病毒具有血凝性,且血凝特性可被新城疫病毒参考阳性血清所抑制,而不能被减蛋综合征病毒、禽流感病毒(H5、H9和H7)阳性血清抑制;该病毒对氯仿、乙醚和酸敏感;致病指数分别为:最小致死量鸡胚平均死亡时间为55.2 h,1日龄雏鸡脑内致病指数为1.8,6周龄雏鸡静脉致病指数为2.39。经鉴定,该分离毒株为鸽副黏病毒Ⅰ型强毒株,将其命名为鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)。

鸽Ⅰ型副粘病毒病 HI抗体水平消长规律的研究

对鸽Ⅰ型副粘病毒病的ＨＩ抗体水平动态进行了调查，发现乳鸽母源抗体水平在１０日龄时最高，达４．４ｌｇ２；鸽Ⅰ型副粘病毒病油苗一免后可保持４个月的较高抗体水平；二免后可保持近１年的高抗体水平；三免之后激发的抗体水平只能保持半年的较高水平。由此提出鸽Ⅰ型副粘病毒病的合理免疫程序。

一株鸽源Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定和F基因序列分析

为了研究山西地区鸽源Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1)的遗传进化规律,试验通过采集疑似病鸽临床病料,经SPF鸡胚传代分离病毒,采用血凝试验和RT-PCR对分离株进行鉴定,扩增分离株F基因部分片段进行同源性分析,并通过病毒毒力测定试验和动物回归试验评价分离株的毒力和致病性。结果表明:从发病鸽群中分离鉴定1株PPMV-1,命名为PPMV-1-SX-011,分离株F基因裂解位点氨基酸序列为^(112)RRQKRF^(117),具有新城疫病毒(NDV)强毒株的典型分子特征;分离株PPMV-1-SX-011与国内流行株Pi/CH/LN/2017、Pi/SH/CH/0168/2013、Pigeon/China/BJ2013、pigeon/China/SDS/2011在遗传进化树上处于同一分支,其中与Pi/SH/CH/0168/2013、pigeon/China/SDS/2011的核苷酸序列同源性高达98.1%和97.7%,属于ClassⅡ基因Ⅵb型;但是与经典疫苗株La Sota、B1、Clone30和Mukteswar株的同源性仅为82.7%~84.5%。分离株PPMV-1-SX-011最小致死量致死鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)、6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)值分别为105.6 h、0.3和0。分离株能引起试验鸡和试验鸽体内的免疫应答反应;对试验鸽的致病力强,而对试验鸡无致病力,表明分离株对鸽有特殊亲嗜性。说明本研究分离得到一株鸽源PPMV-1,其具有NDV强毒株裂解位点,对鸡的致病力却与传统NDV存在明显差异,提示山西地区存在对鸽具有强致病性的NDV弱毒株的基因变异株。

鸽Ⅰ型副黏病毒与大肠杆菌混合感染的诊治

2004年冬季,某养鸽场引进的乳鸽发生大批死亡。为查清其发病原因,通过临床症状、病理剖检及实验室检查,确诊为鸽Ⅰ型副黏病毒和禽大肠杆菌混合感染。根据药敏试验结果,提出了防制措施。经过临床应用,取得较好的效果。

鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)纯化及其检验

在鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)分离鉴定试验确定为鸽副黏病毒Ⅰ型强毒株的基础上,对该病毒株进行了蚀斑纯化,获得了鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)纯化毒株,并对纯化株传代后进行无菌检验、血凝试验、血凝抑制试验和病毒含量测定。结果显示,该纯化毒株纯净、有血凝性和血凝抑制性,病毒含量为10^(8.5)ELD_(50)/0.1 mL,初步判定纯化的鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)可作为鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)免疫效力试验攻毒毒株。

山东地区三株鸽Ⅰ型副粘病毒的分离及鉴定

2005年在山东地区部分肉鸽养殖场出现鸽子大量死亡现象,从死亡鸽中分离到三株鸽Ⅰ型副粘病毒(SD05027,SD05028,SD05029),其鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为69h,69.6h,81.6h;鸡脑内接种指数(ICPI)为1.31,1.43,1.48,证明此次分离的三株病毒株均属速发型新城疫病毒。应用RT-PCR技术对F基因重要功能区片段扩增后进行序列测定,分析表明,F蛋白裂解位点处的序列(112R/K-R-Q-K-R-117F)与新城疫强毒在这一区域的序列相符。与多株已报道的NDV参考株相应片段进行序列比对和基因进化树分析,将其鉴定为基因VIb型。

鸽禽Ⅰ型副粘病毒油佐剂灭活苗免疫效果观察

用鸽Ａ／ＰＭＶⅠ油佐剂灭活苗和ＮＤＶＬａｓｏｔａ 油佐剂灭活苗分别免疫肉种鸽，２０ ｄ 抗体水平达到峰值，在３ ．００ｌｏｇ２ 以上维持３０ ｄ 以上。４０ ｄ 后用鸽Ａ／ＰＭＶⅠ和ＮＤＶＦ４８Ｅ９ 分别进行攻击，对于ＮＤＶＦ４８Ｅ９ 的攻击，保护率均为１００ ％ ，对于鸽Ａ／ＰＭＶⅠ的攻击，鸽Ａ／ＰＭＶⅠ油佐剂灭活苗保护率为１００ ％ ，ＮＤＶＬａｓｏｔａ 油佐剂灭活苗保护率为６６．７ ％ 。田间试验，抽检４８ 份血样，抗体平均为４ ．

一株广西鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及F基因序列分析

为了确定鸽Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1)分离株的基因型及遗传变异,试验对广西某鸽场疑似感染PPMV-1的临床样品进行RT-PCR诊断、病毒分离鉴定和人工感染试验,并对分离株进行F基因测序、相似性分析及构建遗传进化树。结果表明:临床样品经RT-PCR扩增可得到特异性目的条带,病毒分离株具有血凝活性并能被特异性新城疫(ND)阳性血清抑制。分离株能引起非免疫鸽发病,发病率和死亡率分别为100%和10%。对分离得到的PPMV-1(命名为pi/CH/GX1026/2016)进行序列分析,该分离株F蛋白的裂解位点为^112RRQKR↓F^117,符合新城疫病毒(NDV)强毒株的特征。pi/CH/GX1026/2016分离株与毒株Grey heron/Ch/GD/GZ333/2015和European turtle dove/Ch/GD/GZ23/2015核苷酸和氨基酸相似性较高,核苷酸相似性分别是99.6%和99.4%,氨基酸相似性分别是99.3%和98.9%;与疫苗株La Sota核苷酸和氨基酸相似性较低,分别是83.8%和88.3%。分离株与基因Ⅵ型NDV毒株Grey heron/Ch/GD/GZ333/2015和European turtle dove/Ch/GD/GZ23/2015遗传关系亲近,与基因Ⅱ型疫苗株La Sota的遗传关系较远。说明pi/CH/GX1026/2016分离株为基因Ⅵ型的PPMV-1,该毒株与NDV常用疫苗株La Sota的遗传关系较远。

几株野生鸟类来源的Ⅰ型禽副粘病毒分子生物学特征的研究

参考GenBank中Ⅰ型禽副粘病毒（Avian paramyxovirus,APMV-1）序列,在F基因的3’端相对保守区设计1对引物,利用RT-PCR方法对华南农业大学兽医学院禽病学教研室近两年来从广州和深圳两个地区分离的4种动物来源共10株Ⅰ型禽副粘病毒毒株的F基因进行扩增,其扩增长度约为450bp。测序结果表明：广州株与NDV的基因Ⅵ型有高度的同源性,1个深圳株与Ⅶ型有较高的同源性,其氨基酸序列均符合F蛋白裂解位点区（112-117）强毒株的氨基酸序列特征;其他4个深圳株均与基因Ⅰ型有很高的同源性,其氨基酸序列均符合F蛋白裂解位点区（112-117）弱毒株的氨基酸序列特征。

马源禽Ⅰ型副黏病毒HN基因的克隆与序列分析

为了解禽Ⅰ型副黏病毒的跨种传播以及对HN基因进行序列分析,运用RT-PCR方法,扩增马源禽I型副黏病毒广西分离株M10株的HN基因,将其克隆至PMD18-T载体中,进行序列测定,序列分析表明,M10株的HN基因片段长度约为2.0kb,ORF为1716个碱基,编码571个氨基酸;ORF区与参考毒株的核苷酸同源性为80.9%-99.2%,推导的氨基酸同源性为88.6%-98.6%。在同源性比较的基础上,进一步绘制禽I型副粘病毒HN基因的系统进化树,分析表明,M10株与参考毒株YG03、NDV-03、FP1等亲缘关系较近。

乳鸽副黏病毒(PPMV-1)与大肠杆菌混合感染的诊断与防治

为了对太原市某肉鸽场乳鸽突发的PPMV-1和大肠杆菌病混合感染病例进行诊断,通过对发病乳鸽进行临床诊断和病理剖检,并采集病鸽的组织病料,进行RT-PCR检测、SPF鸡胚传代分离病毒和细菌分离培养、生化鉴定、药敏试验和动物回归试验,旨在制定出综合防治措施,对PPMV-1和大肠杆菌病混合感染疾病的预防和治疗提供指导意义。结果显示,该鸽场鸽群感染病毒为鸽源Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1),分离菌为大肠杆菌。药敏试验表明,分离菌对氨基糖苷类药物部分高敏。根据诊断结果,紧急使用新城疫IV系疫苗免疫,同时联合使用丁胺卡那霉素,病情迅速得到控制。抗体检测发现,该鸽场种鸽新城疫抗体效价参差不齐,是诱发乳鸽感染PPMV-1的主要原因。动物回归试验进一步确定了PPMV-1分离株和大肠杆菌的致病性,乳鸽感染PPMV-1后发病率为100%,死亡率达80%;而雏鸡感染病毒后无明显临床症状,表明PPMV-1分离株对乳鸽和雏鸡的致病力存在差异,且混合感染比病毒和大肠杆菌单独感染死亡率高,在乳鸽养殖中要重视综合防控,防止PPMV-1和大肠杆菌混合感染的发生。

五株鸽副粘病毒国内分离株F基因片段的克隆与分子特性

Five isolates of pigeon paramyxovirus Ⅰ（PPMV-Ⅰ）,designated as YZ9712,NC9701,NP9904,PB9601 and SZa9803,were isolated from pigeons during epizootics recently in China.The F gene functional domains were amplified by RT-PCR and then cloned into pGEMDR○-T vector and sequenced.A phylogenetic tree based on nucleotide sequence of the F gene segment revealed all the strains were divided into seven genotypes,and five PPMV-Ⅰ isolates similar to strains 1168/84 and 760/83 were grouped into subgenotype Ⅵb.The homology between these five isolates were 98.3%～99.4% and 97.8%～99.4% at the nucleotide and amino acid levels respectively.The deduced amino acid sequence at the cleavage site of the F protein was of virulent strains112K-R-Q-K-R-F117?All the isolates had highly genetic similarity to the England reference strain 1168/84 and Wales reference strain 760/83 of PPMV-Ⅰ,suggesting that they might have originated from a common ancestor.