分子标记辅助选择Pigm基因改良水稻不育系桃农1A的苗瘟抗性

为了改良桃农1B和桃农1A的苗瘟抗性,以携带广谱持久抗稻瘟病基因Pigm的中国地方水稻品种谷梅4号为供体亲本,先后以三系保持系桃农1B及其不育系桃农1A为受体亲本,利用与Pigm紧密连锁共显性DNA标记T9E3开展辅助选择育种。T9E3在桃农1B或桃农1A基因组中的PCR扩增条带约为2 000 bp,而对谷梅4号基因组的扩增产物大小为926 bp,多态性稳定;采用来自国内外不同稻区的32份稻瘟菌菌株室内接种苗瘟,桃农1B和桃农1A抗性频率均为9.38%,谷梅4号与改良系抗性频率均为90.63%;田间天然病圃鉴定桃农1B和桃农1A苗瘟8级,而改良系和供体亲本谷梅4号苗瘟均为0级。通过T9E3辅助选择、田间病圃筛选和室内接种鉴定,初步获得了3份高抗稻瘟病的改良不育系(桃农1A-Pigm-1—桃农1A-Pigm-3)及其保持系(桃农1B-Pigm-1—桃农1B-Pigm-3),进一步通过不育特性、农艺性状与产量结构调查分析,从中遴选出1个高抗稻瘟病、不育性稳定、包颈率低、农艺产量性状优良的优异不育系桃农1A-Pigm-2及其配套保持系桃农1B-Pigm-2。桃农1A-Pigm-2不育度和不育株率均为100%,典败花粉约占60%、圆败花粉约占40%,柱头外露率高达71.1%,包颈粒率仅为33.6%;桃农1B-Pigm-2播始历期为69 d,株高76.2 cm,主穗穗长28.1 cm,单株有效穗数15.8穗,单穗总颖花数115.3个,千粒质量27.7 g。实现了桃农1A和桃农1B苗瘟抗性及其他性状的综合改良,为三系杂交水稻育种应用创制了新的亲本材料。

分子标记辅助选育含Pigm抗稻瘟病基因的水稻新品系

为选育具有稻瘟病广谱抗性的水稻粳型新品系,将柱头外露率高的晚粳类型保持系嘉66B与华粳5号杂交后,筛选获得F3代优异中间材料,再与携带稻瘟病抗性基因Pigm的供体材料金香玉1号杂交,利用分子标记选择定位携带Pigm基因的粳型后代,通过人工气候室加速育种品种,并对农艺性状等进行评价,成功筛选出抗稻瘟病的粳型常规稻3份(T2、T143、T146),稻瘟病抗性水平达到高抗级别,综合性状优良。

Pigm特异性选择标记的开发及其在粳稻穗颈瘟抗性育种中的利用

【目的】Pigm是一个广谱的稻瘟病抗性基因,源自持久抗性品种谷梅4号,与Piz、Piz-t、Pi2、Pi9和Pi40等互为复等位基因但抗谱存在差异。为了更好地在分子辅助选择育种中利用Pigm基因,开发与Pigm特异性标记具有重要意义。【方法】在已有文献报道定位结果的基础上,通过随机测序获得了一段谷梅4号基因组的特异序列,并据此开发了一组用于筛选Pigm基因的分子标记,进一步选取江淮稻区3个不同生态型代表性粳稻品种作为受体,利用分子标记辅助选择结合对抗性基因的背景检测将Pigm基因导入受体品种。【结果】Pigm-4标记位于Pigm基因簇内部,与抗病功能元件Pigm R紧密连锁,对不同类型的品种检测发现该标记特异性强,且利用该标记可将Pigm与Piz、Piz-t、Pi2、Pi9以及Pi40区分开来。对受体亲本稻瘟病抗性基因的检测和接种结果分析发现江淮稻区粳稻品种虽然携带了Pib、Pi54、Pita、Pb1中的2~3个基因,但是对强毒力的稻瘟病小种抗性普遍不强,而3种代表性粳稻背景下导入Pigm基因均可显著提高其对穗颈瘟的抗性水平。【结论】Pigm可以作为抗稻瘟病粳稻育种的有利基因资源加以利用,而Pigm-4是分子标记辅助筛选Pigm的优异标记。

水稻广谱抗稻瘟病基因PigmR功能标记的开发及应用

【目的】稻瘟病是世界上最严重的水稻病害之一。通过功能标记的开发,为加快广谱持久抗稻瘟病基因PigmR在水稻育种中的应用提供依据。【方法】利用Snapgene 2.3.2软件分析PigmR的碱基变异特征,用Oligo7设计特异功能标记。为了避免因PCR扩增失败引起的假阴性,设计扩增内参基因Actin1的引物作为参照,对功能标记进行优化。用功能标记对水稻亲本材料、丽江新团黑谷的单基因系材料、育种中间材料和南粳53045/谷梅4号BC1F3群体株系进行鉴定。稻瘟病鉴定的供试菌株为江苏省稻瘟病代表菌株(2018-4、2018-65、2018^(-1)02、2018-222和2018-241)的混合菌。将供试菌株移植RCA培养基上,25℃培养7 d,用黑光灯照射72 h,待稻瘟病菌产生孢子后,再用无菌水洗下,配成10×10倍显微镜下每视野30—40个孢子的悬浮液。于水稻抽穗前3—4 d注射混合菌株,每穗注射1 mL菌液,做好标记。在水稻灌浆饱满后进行抗性调查。【结果】根据PigmR与PigmS、Pigm-R4序列比对及差异分析,设计了8对分子标记引物。通过分子检测,筛选获得的PigmR功能标记GMR-3,能特异扩增来源于谷梅4号的PigmR,获得98 bp产物,而不携带PigmR扩增不出产物。以不同浓度配比优化GMR-3与内参基因Actin1检测引物Actin1^(-1),发现以0.4μmol·L^(-1) GMR-3与0.1μmol·L^(-1) Actin1^(-1)组合浓度扩增出PigmR和Actin1特征条带的效率相当,效果最优,将该标记命名为GMRA。用该标记扩增水稻样品,携带PigmR的样品能扩增出146和98 bp条带,不携带PigmR的样品仅能扩增出146 bp条带。利用GMRA标记检测229份水稻材料,只有谷梅4号能扩增出146和98 bp条带,其他籼稻和粳稻均只能扩增出146 bp条带。进一步对29份丽江新团黑谷的单基因系材料进行检测发现,GMRA标记能有效区分PigmR与Pi9、Piz、Piz-t等同源性较高的基因,有很好的特异性。利用GMRA标记,从240份育种中间材料中筛选到3份携带PigmR的材料,可作为该基因的供体材料。利用该标记进行分子标记辅助选择,将PigmR通过回交转育到优质食味粳稻南粳53045。对南粳53045/谷梅4号BC1F3群体单株进行分子标记检测及稻瘟病人工接种鉴定,发现携带PigmR的单株均表现为抗或中抗,不携带PigmR的单株均表现为高感,表明导入PigmR能显著改良南粳53045的穗颈瘟抗性。【结论】PigmR的功能标记能有效用于抗稻瘟病遗传改良和资源筛选。

利用Pigm基因改良粳稻保持系的稻瘟病抗性研究

选育和应用抗病品种是防治水稻稻瘟病经济有效的技术途径。为了改良粳稻保持系浙04B的稻瘟病抗性,以含稻瘟病广谱抗性基因Pigm的粳稻材料MP3为供体亲本,浙04B为受体亲本,通过杂交、回交并结合分子标记辅助选择,将Pigm基因导入浙04B中,利用分布于水稻12条染色体上的47个多态性SSR标记检测近等基因系的遗传背景回复率,获得了23份背景回复率>0.80的近等基因系。选用4个浙江省稻瘟病优势菌株Zj-5、Zj-8、13-37和13-41人工接种鉴定,23份近等基因系均表现为抗穗颈瘟。田间自然诱发鉴定结果表明,23份近等基因系叶瘟为0级,穗瘟均为1级,表现为抗穗瘟,表明近等基因系稻瘟病抗性明显提高。对10项农艺性状的考察结果表明,导入Pigm基因的近等基因系剑叶变短,千粒重增加,生育期延迟,株高增加,有效穗数、每穗总粒数和产量总体减少。本研究结果为选育抗稻瘟病新品种提供了材料,同时为Pigm基因抗病育种应用提供了参考。

抗稻瘟病基因Pigm导入对寒地粳稻抗病性和产量性状的影响

为提高黑龙江省寒地粳稻稻瘟病抗性,通过杂交、回交、自交选育和分子标记辅助选择技术,将籼稻品种谷梅4号的广谱抗稻瘟病基因Pigm导入到寒地优良粳稻品种空育131、龙粳26和垦鉴稻6中,获得12个携带Pigm基因的优良导入系。与受体亲本相比,各导入系对稻瘟病菌的抗谱大幅提高,抗性频率最高达98.4%,最低为95.2%。同时对穗颈瘟的抗性也显著提高,导入Pigm基因后空育131穗颈瘟抗性由7级提高到1级,龙粳26穗颈瘟由5级提高到0～1级,垦鉴稻6穗颈瘟由7级提高到1～3级。结果还表明Pigm基因的导入影响株高和产量性状,其表现为株高增加,穗粒数增加,结实率下降,其中5个导入系产量显著提高。综合抗病性和产量性状可知,这5个Pigm基因的导入系可用于抗稻瘟病育种中。

稻瘟病广谱抗性基因Pigm特异性分子标记的开发和应用

【目的】来自籼稻品种谷梅4号的Pigm是一个对稻瘟病菌具有广谱和持久抗性的重要基因。为有效提高Pigm基因的选择效率,有必要开发具有特异性的共显性分子标记进行辅助育种。【方法】本研究根据谷梅4号Pigm位点存在的特异性核苷酸变异,利用Tetra-primerARMS-PCR和KASP两种不同的基因分型技术开发出分子标记T-Pigm和K-Pigm,对不同品种(品系)以及淮稻9号/谷梅4号的F2分离群体进行基因型检测,并结合穗颈瘟人工接种鉴定,对标记的准确性进行评价。【结果】序列比对分析表明,谷梅4号Pigm位点中Pigm-Nbs2基因起始密码子上游515 bp处存在一个特殊的单核苷酸变异。利用已开发的两种类型的分子标记能够有效区分3种不同的基因型,且基因型与穗颈瘟人工接种鉴定结果完全一致。【结论】利用分子标记T-Pigm和K-Pigm可以实现对Pigm基因型快速、准确的检测,加快抗稻瘟病水稻新品种的选育进程。

水稻抗稻瘟病Pigm(t)基因的分子标记辅助选择与利用

旨在快速改良武运粳29196的稻瘟病抗性。采用定向回交育种策略,运用分子标记辅助选择技术和花药培养技术,快速改良武运粳29196的稻瘟病抗性。以籼稻品种谷梅4号为稻瘟病抗性基因Pigm(t)的供体,以高产易感稻瘟病的品系武运粳29196为受体,在连续回交和自交过程中,利用与Pigm(t)紧密连锁的In Dels标记S95477和S29742进行分子标记辅助选择。在BC2F1世代,进行花药培养,获得185个双单倍体群体(DH群体),从中筛选出82个含有Pigm(t)基因的改良株系。在经过对农艺性状、稻瘟病抗性的系统鉴定与稻米品质性状测定后,发现改良株系DH036和DH158的综合性状与武运粳29196已十分相近,且稻米品质有所提升,保持了武运粳29196丰产性的同时,稻瘟病抗性有了明显的提高。利用定向回交、花药培养和分子标记辅助选择相结合的技术体系,可明显提高稻瘟病抗性改良的预见性和准确性,缩短育种年限、加快育种进程。新育成的武运粳29196抗性改良系,为稻瘟病抗性育种提供了重要的遗传资源。

抗稻瘟病基因Pigm组合标记的开发及应用

Pigm是水稻抗稻瘟病基因之一,抗性广且持久。针对Pigm基因,已开发多种分子标记,但检测特异性或辨识度尚存不足。通过NCBI对7个Pigm标记进行序列比对分析,包括Pigm-4、T9E4、DG-2、M80410、R060939、GMR-3和T-Pigm,并对40个水稻品种开展检测验证。根据序列分析与检测结果开发了一种组合标记,应用于镇糯19×空育131(Pigm)分子标记辅助选择育种。序列分析结果表明,M80410标记特异性强,但不能区分杂合基因型;Pigm-4、T-Pigm和T9E4等标记能区分杂合基因型,但特异性略有不足。结合水稻品种检测结果,筛选了Pigm-4与M80410作为组合标记,并用于辅助育种,选育了糯稻品系NK29,具有较好稻瘟病抗性。组合标记能快速准确地鉴定Pigm 的纯合显性、纯合隐性和杂合基因型,为Pigm分子育种奠定基础。

PigM基因在小鼠中的表达及其在精子发生中的功能探讨

目的筛选与精子发生相关的基因。方法将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交,通过杂交信号的比较,筛选出差异表达的基因。利用网络信息资源对该基因进行生物学信息分析。RT-PCR分析该基因在小鼠不同发育阶段睾丸及小鼠不同组织中的表达。结果通过4、91、8、35、54、日龄和6月龄小鼠睾丸的芯片信号比较筛选出一个差异表达杂交点(GenBank登录号:NM-026234),生物信息学分析发现该基因全长3 979 bp,含有1 272 bp的完整ORF,编码一个有423个氨基酸、分子量为49.788的蛋白质。PigM蛋白与大鼠同源基因PigM蛋白有96%的同源性,与人PigM蛋白有89%的同源性,显示该基因在哺乳动物中高度保守。RT-PCR分析表明PigM基因特异性表达于睾丸组织及18日龄后的小鼠睾丸中。结论PigM基因的表达与小鼠精子发生的过程一致,显示其可能在精子发生中起着重要作用。解释该基因的生物学功能,可对揭示人类无精、弱精和少精引起的男性不育的病因,治疗和预防男不育及寻找新的男子避孕药的靶位点具有重要意义。

晚粳稻不育系浙08A的选育与应用

为改良晚粳稻不育系浙04A(B)的稻瘟病抗性,以携稻瘟病广谱抗性基因Pigm的MP3为抗瘟基因供体,通过连续多代回交核置换并结合分子标记辅助选择的方法,育成了抗稻瘟病、早花时的BT型晚粳稻不育系浙08A(B),2015年9月通过浙江省农作物品种审定委员会鉴定(浙育审2015007)。浙08A育性稳定,群体不育株率100%,花粉败育率99.993%,不育花粉以染败为主,染败率88.427%。经人工接种和病圃自然诱发鉴定,浙08A稻瘟病抗性较浙04A有明显改善。浙08A具有花时较早且开花集中,与籼粳型恢复系花时相遇良好、制种异交率高等优点。利用浙08A配制的杂交组合表现出较强的杂种优势及良好的稻瘟病抗性。

抗稻瘟病晚粳稻不育系浙07A的选育与应用

以携Pigm基因的粳稻材料MP3为抗稻瘟病基因供体,通过回交转育,结合分子标记辅助选择,快速改良晚粳稻不育系浙04A的稻瘟病抗性,育成了BT型抗稻瘟病晚粳稻不育系浙07A及其保持系浙07B,2012年9月通过浙江省农作物品种审定委员会鉴定(浙育鉴2012006)。该不育系不育株率100%,花粉败育率99.99%,不育花粉以染败为主,其中染败率83.73%。经人工接种鉴定,为高抗稻瘟病。所配组合与原不育系浙04A相比较,分蘖数多、穗型大、粒重高,表现产量优势明显、稻瘟病抗性增强等特性。

分子标记辅助选育携带抗稻瘟病基因Pigm的光温敏不育系

为选育具有稻瘟病广谱抗性粳型两系不育系,将高柱头外露率中粳类型不育系DS39与优质晚粳水稻嘉58进行杂交,通过花药培养选育出晚粳类型不育系TS849,再将TS849与携带稻瘟病抗性基因Pigm的迟熟中粳水稻品种1350杂交,通过花药培养技术创制一批加倍单倍体,利用分子标记选择携带Pigm基因的不育系,并对农艺性状等进行评价,成功选育出抗稻瘟病的晚粳类型光温敏不育系1份(JF35-2)。JF35-2稻瘟病抗性水平达到高抗级别,可作为抗原应用于抗稻瘟病杂交晚粳育种。

聚合R基因Pigm和非R基因bsr-d1改良水稻稻瘟病抗性

综合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因芯片技术,聚合主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1,以改良优良食味水稻品种水晶3号的稻瘟病抗性。首先利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以Bsr-d1为靶基因构建重组表达载体并通过农杆菌介导法转化水晶3号,筛选获得无T-DNA元件的bsr-d1纯合突变体,包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5种突变类型。以无T-DNA成分的bsr-d1纯合突变体为母本、以携带Pigm基因的金玉1号为父本杂交、回交、自交,并利用分子育种芯片同时进行Pigm基因和背景辅助选择,最终获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合,且背景回复率均在96%以上的水晶3号改良株系(SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5)。稻瘟病抗性鉴定结果表明,各改良株系对稻瘟病生理小种GUY11的叶瘟抗性与野生型相比均显著提高;接种稻瘟病菌后,改良株系叶片中POD活性显著低于野生型对照,H_(2)O_(2)含量则显著高于野生型对照。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术结合基因芯片技术获得了同时携带bsr-d1和Pigm基因的抗稻瘟病水晶3号改良系。

分子标记辅助选择Pigm基因改良湘晚籼13号的稻瘟病抗性

以湘晚籼13号、谷梅4号、75–1–127(CK1)和CO39(CK2)为材料,用21份来自不同稻区的稻瘟菌菌株室内接种,采用室内苗瘟鉴定和田间病圃鉴定的方法,明确Pigm基因供体亲本谷梅4号和受体亲本湘晚籼13号的稻瘟病抗性表现及抗菌谱;根据Pigm基因序列信息,设计和筛选高效多态分子标记T9E4;利用获选分子标记,开展分子标记辅助选择(MAS)连续回交育种实践,培育高抗病株系。结果表明:Pigm基因供体亲本谷梅4号和受体亲本湘晚籼13号的抗性反应及抗菌谱存在明显差异,抗性频率分别为95.2%和61.9%。大田病圃稻瘟病抗性鉴定表明,谷梅4号高抗苗瘟和穗瘟,而湘晚籼13号高感苗瘟和穗瘟。T9E4标记引物在谷梅4号和湘晚籼13号基因组中分别扩增出1条约750 bp和1条约1 800 bp的稳定明亮条带,且PCR产物可以用琼脂糖凝胶电泳快速检测,标记辅助选择效率达100%。通过连续回交、自交及分子选择,培育出1个含有Pigm纯合等位基因、高抗苗瘟和穗瘟,且主要农艺性状与湘晚籼13号高度相似的BC5F3株系,实现了定向改良目标。

分子标记选择改良水稻两系不育系创5S稻瘟病抗性

选用水稻两系不育系创5S为改良对象,利用分子标记辅助选择技术将广谱抗稻瘟病基因Pi40和Pigm导入到创5S中。通过杂交和回交并结合农艺性状筛选,获得了分别携带Pigm基因(17S10、17S11和17S13)和Pi40基因(17S16、17S18、17S19)且农艺性状与轮回亲本创5S基本一致的改良不育系株系。抗性鉴定结果显示:不育系改良株系17S11、17S13、17S18的稻瘟病抗性已达抗病等级,17S10、17S16、17S19的稻瘟病抗性已达中等抗病。

褐飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建及PIGM互作蛋白的筛选

目的:构建用于酵母双杂交的褐飞虱cDNA文库以及pGBKT7-NlPIGM诱饵载体,筛选与NlPIGM具有相互作用的蛋白。方法:以褐飞虱全虫mRNA为起始模板,采用CloneMiner构建褐飞虱cDNA文库并通过涂布鉴定文库库容量和滴度,通过两步法构建pGBKT7-NlPIGM诱饵载体并鉴定重组诱饵载体的自激活活性及毒性,然后通过mating法筛选与NlPIGM具有相互作用的蛋白。结果:构建的初级cDNA文库总库容为1.04×10^(8) CFU,次级cDNA文库滴度为3.4×10^(7) CFU/mL,重组率为100%,插入片段大小集中在750~2000 bp之间;pGBKT7-NlPIGM载体无自激活活性,对Y2H Gold酵母菌株无毒性。并筛选到9个能与NlPIGM互作的蛋白。结论:成功构建了可用于酵母双杂交的高质量褐飞虱cDNA文库及褐飞虱PIGM诱饵载体,并筛选到了能与NlPIGM互作的蛋白。

水稻广谱抗瘟基因Pigm紧密连锁分子标记开发及其育种应用

根据广谱抗瘟基因Pigm精细定位结果,筛选获得共显性InDel标记DG-3在Pigm基因供体亲本谷梅4号与9个籼稻受体亲本之间存在明显且稳定的多态性。在T98B×谷梅4号和R640×谷梅4号2个组合的BC1F1群体中随机取单株进行稻瘟病抗性表型及基因型分析,结果表明,无论是田间病圃鉴定,还是室内接种鉴定,分子标记DG-3对这2个组合回交群体的抗稻瘟病表型选择效率达95%以上,说明DG-3与Pigm基因紧密连锁。在此基础上,采用分子标记辅助选择与回交育种相结合的方法,利用DG-3在9个组合的回交群体中选择含有目的基因的单株分别与相应轮回亲本逐代回交,分别获得了9个组合的BC3F1群体,为进一步连续回交定向改良轮回亲本的稻瘟病抗性奠定了基础。

分子标记辅助选择改良早籼稻1701的稻瘟病抗性

利用广谱持久抗瘟基因Pigm的紧密连锁标记S29742,通过分子标记辅助选择和连续回交育种实践,定向改良早籼稻1701的稻瘟病抗性。获得以下主要结果:Pigm基因供体亲本谷梅4号与受体亲本1701对23份供试稻瘟菌菌株的抗性表现及抗菌谱差异显著,两亲本的抗性频率分别为95.7%和39.1%。S29742是一个基于PCR的共显性DNA标记,在谷梅4号和1701之间多态性明显且稳定,在两亲本中分别扩增出一条约550 bp和一条约900 bp的条带;S29742标记基因型对稻瘟病抗性表型的选择效率可达100%。通过连续回交、选择和自交,获得含Pigm基因的BC5F2群体,在此基础上通过基因型和表型分析鉴定出3个高抗稻瘟病的BC5F3株系,并通过田间主要农艺及产量性状分析,育成一个遗传背景与受体亲本相似的抗瘟水稻新品系"1701-Pigm"。

利用广谱抗病基因Pigm改良水稻稻瘟病抗性

为改良已选育的高产优质粳稻高代新品系的稻瘟病抗性,以引进的携带有水稻广谱抗稻瘟病基因Pigm的籼稻品种谷梅4号和粳稻材料MP3为供体,利用花粉管通道技术将其基因组DNA导入到SD-2、SD-3、SD-4、SD-5、SD-6、DJ13、ZD15、14PB1和14PB4等高代品系和品种宁粳43号中,利用Pigm基因的显性标记M26205和M80410对受体及获得的导入系进行检测,结果表明:在所有受体中,两个标记均未扩增出条带,说明所有受体本身都不含Pigm基因;在检测的854株导入株系中,利用标记M26205检测总共有328株能够扩增出856 bp,或1 019 bp和856 bp的条带,初步推断这328个株系携带有Pigm基因,平均阳性株率为40.51%;利用标记M80410检测总共有169株能够扩增出517 bp的条带,推断这169个株系可能携带有Pigm基因,平均阳性株率为19.83%。选择两个标记能同时检测出的阳性植株107株作为Pigm基因的导入系,进行进一步的加代培育和辅助选择。