PIWILl蛋白与DICER酶在肝细胞癌中的表达及意义

目的探讨P1WIL1蛋白与DICER酶在肝细胞癌组织中的表达及临床意义。方法免疫组化检测47例肝细胞癌标本中PIWILl与DICER的表达。蛋白印迹法检测31例肝细胞癌组织中PIWILl与DICER的表达。分析PIWIL1与DICER表达及与临床特征的关系。结果P1WIL1在癌组织中高表达，在正常肝组织中低表达（P〈O．05）。DICER在正常肝组织中高表达，在癌组织中低表达或缺失（P〈0．05）。PIWILl和DICER与肿瘤分化程度、临近组织侵犯相关（P〈O．05），PIWIL1与DICER在组织中的表达呈负相关（P〈0．05）。结论PIWILl的高表达和DICER的低表达或缺失与病理分化程度及临近组织侵犯相关，PIWILl与DICER的表达负相关。

多花黄精对少弱精子症大鼠生精细胞凋亡的保护作用及药效物质基础研究

目的阐明多花黄精对少弱精子症大鼠模型生精细胞凋亡的保护作用及药效物质基础。方法采用UHPLC-Q Exactive Focus HRMS技术鉴定多花黄精化学成分,及其提取物灌胃给予大鼠后在血清和睾丸组织中的化学成分。设置空白组、模型组、阳性药组(左卡尼汀300 mg/kg)及多花黄精高、中、低剂量组(10、5和2.5 g/kg),考察其改善少弱精子症的药理作用,每组6只大鼠。通过HE染色观察大鼠睾丸组织病理形态,TUNEL染色观察大鼠睾丸生精细胞的凋亡情况,免疫荧光法检测DNMT3A和PIWIL1蛋白表达。结果从多花黄精提取物、大鼠血清、大鼠睾丸中分别鉴定出138种、23种、30种化学成分。模型组大鼠睾丸曲细精管中大量生精细胞凋亡,DNMT3A和PIWIL1蛋白低表达,而多花黄精高、中剂量组大鼠睾丸曲细精管中TUNEL阳性生精细胞数量减少,DNMT3A和PIWIL1蛋白表达显著升高。结论多花黄精对少弱精子症大鼠具有保护作用,其可能是通过上调大鼠睾丸中DNMT3A和PIWIL1的表达,逆转生精细胞的凋亡。

Piwil2重编程人成纤维细胞形成肿瘤干细胞的初步研究

目的初步观察精原干细胞自我更新基因Piwil2重编程人成纤维细胞的细胞形态及功能特征变化,建立Piwil2调控肿瘤干细胞发生过程的细胞实验模型。方法将携带Piwil2-GFP标记和空载目的基因GFP标记的慢病毒载体分别感染原代培养的小儿包皮成纤维细胞,筛选建立稳定表达Piwil2-GFP和GFP成纤维细胞系,观察细胞形态变化及肿瘤球形成过程,分析细胞染色体核型,进行裸鼠体内成瘤实验,RT-PCR、免疫组织化学进一步鉴定重编程后细胞的干细胞特征及三胚层分化的相关标志物。结果转染后第5天,Piwil2-GFP成纤维细胞开始由长梭形逐渐转变为圆形,第14天出现集落样生长状态,挑选集落重悬后培养形成类似"肿瘤球"样克隆,其细胞染色体核型呈超二倍体的异质性改变。"肿瘤球"样克隆裸鼠体内移植2周时100%形成肿瘤,肿瘤组织学及免疫组化鉴定为表达多种外胚层、中胚层及内胚层肿瘤标志物的恶性肿瘤,RT-PCR显示细胞及裸鼠肿瘤表达干细胞多能基因Oct-4、Nanog、Sox2,以及三胚层特征标志物。结论Piwil2重编程人成纤维细胞后的细胞具有干细胞及多潜能分化特性,以及显著的肿瘤细胞异质特性。

沉默 Piwil2表达对子宫颈癌细胞增殖和衰老的影响

目的采用shRNA沉默Piwil2基因的表达,探讨其对宫颈癌细胞株增殖和衰老特性的影响。方法通过脂质体Lipofectamine2000转染技术和嘌呤霉素筛选,建立稳转Sh-piwil2宫颈癌细胞株,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot法验证沉默效果。采用细胞增殖实验、集落形成实验、细胞周期和细胞衰老等实验观察沉默Piwil2表达对宫颈癌细胞生物学特性的影响。结果建立稳定转染Sh-piwil2宫颈癌细胞株,与对照组相比,沉默Piwil2表达后细胞的增殖和集落形成能力均显著降低(P<0.05);细胞G0/G1期比例增加、S期比例明显下降(P<0.05),同时沉默Piwil2后细胞衰老数量明显增多(P<0.05)。结论沉默Piwil2基因可发挥抗宫颈癌作用,推测Piwil2基因可作为宫颈癌临床治疗的一个潜在靶点。

PIWIL1在不同肿瘤细胞中的差异性表达

PIWI作为AGO蛋白家族的成员,在睾丸中特异表达,在精子形成过程中扮演着重要角色.已有文献报道,PIWIL2也广泛存在于多种肿瘤中,与肿瘤的发生相关.本文旨在确定PIWL1在不同肿瘤细胞中的表达差异性,进而初步探讨PIWIL1的表达差异与肿瘤发生发展的关系.半定量RT-PCR和Western印迹检测多种肿瘤细胞中,PIWIL1在mRNA水平及蛋白水平的表达情况,进一步用免疫组化和免疫荧光检测PIWIL1在细胞中的表达及定位.PIWIL1在多种肿瘤细胞中的表达存在差异,其中一些肿瘤细胞中的表达水平较高,包括卵巢癌,前列腺癌,肝癌,胃癌等细胞.对于肿瘤细胞而言,PIWIL1定位于细胞浆中.因此,PIWIL1在多种肿瘤细胞中的表达差异性可能为肿瘤发生发展的研究提供新的线索.

抗PIWIL2蛋白多克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备兔抗人PIWIL2(P-element-induced wimpy testislike 2,或称HIWI2)的多克隆抗体,并鉴定其特异性,初步探讨其在人正常及肿瘤组织中的分布。方法:人工合成特异性PIWIL2多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)为载体构建多肽免疫原,致敏大白兔,制备兔抗人PIWIL2多克隆抗体。亲和层析法纯化抗体,ELISA和Western印迹鉴定特异性,人组织芯片行PIWIL2的免疫组化研究。结果:通过构建PIWIL2多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,制备出兔抗人PIWIL2蛋白多克隆抗体。ELISA及Western印迹证实兔抗人PIWIL2抗体可特异性识别PIWIL2多肽。人组织芯片免疫组化染色显示,PIWIL2在肿瘤细胞的表达具有组织特异性,大多数正常和癌组织的平滑肌细胞胞质中呈阳性染色。结论:成功制备出兔抗人PIWIL2多克隆抗体,为后续研究奠定了基础。

鸡不同生精细胞中Piwil1基因启动子区DNA甲基化差异研究

旨在通过检测不同类型生精细胞中Piwil1基因的转录水平和启动子区甲基化状态,为深入探讨该基因在鸡精子发生过程中的转录调控机制奠定基础。通过荧光定量PCR技术检测Piwil1基因在不同生精细胞的mRNA表达水平,同时采用Bisulfite sequencing PCR法对启动子区进行甲基化修饰、转化和克隆测序,分析甲基化状态。结果发现,鸡Piwil1基因在精子中几乎不表达,在精原细胞的表达量显著高于PGCs、SSCs和四倍体(P<0.01)。鸡Piwil1基因启动子区-233^+298bp存在1个CpG岛,该岛有56个CpG位点。第1~10个CpG位点(-233^-129bp区域),精子细胞、四倍体细胞、PGCs、SSCs中处于未甲基化状态,而精原细胞中甲基化比例高达0.600;第39~55个CpG位点(+105^+252bp区域),不同细胞中的甲基化水平差异显著,精原细胞中仅为0.212。PGCs、SSCs中DNA高甲基化在一定程度上抑制了Piwil1基因的表达。研究表明:在+105^+252bp非编码区域甲基化可能对Piwil1基因转录调控有一定影响,但还存在其他转录调控机制。

肿瘤抗原PIWIL2的HLA-A2限制性CTL表位鉴定

目的:鉴定肿瘤抗原PIWIL2的人类白细胞抗原A2(HLA-A2)限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。方法:首先运用RT-PCR、Western blot方法检测PIWIL2在肿瘤细胞系MCF-7、SW480和HT-29中的表达情况,然后通过BIMAS、Rank Pep、Net MHC、Net CTL1.2及IEDB软件预测打分来选取PIWIL2的HLA-A2限制性的表位。候选表位肽通过标准的Fmoc化学合成法合成,结合力实验用于检测候选表位与T2A2细胞表面HLA-A2分子的结合能力,ELISPOT实验检测候选表位肽诱导CTL分泌IFN-γ的能力,体外细胞毒性实验检测候选肽诱导CTL的能力。结果:PIWIL2在肿瘤细胞系MCF-7、SW480和HT-29中均有表达。候选肽P485、P493、P965具有中等结合力。ELISPOT实验结果显示表位肽P485和P965诱导的CTL具有分泌IFN-γ的能力。细胞毒性实验结果显示表位肽P485和P965对MCF-7细胞均有一定的杀伤作用。结论:表位肽P485和P965是优秀的PIWIL2抗原HLAA2限制性CTL候选表位,可能成为新的抗肿瘤多肽免疫治疗疫苗的候选表位。

人PIWIL3特异性抗体的制备和PIWIL3蛋白在肿瘤组织中的分布

目的:制备人Argonaute家族中PIWIL3蛋白的特异性抗体,并检测其在人多种肿瘤组织中的表达和分布。方法:根据序列同源性和多肽免疫性,利用内部多肽选择数据库选择最佳的多肽免疫原合成多肽,再与KLH结合用于免疫;免疫所得的抗血清经多肽包被的凝胶进行亲和层析纯化,酶联免疫吸附分析技术(ELISA)检测纯化后抗体与多肽的结合能力,Westernblot检测抗体对相应蛋白的结合能力。人肿瘤组织芯片检测该蛋白在多种肿瘤组织的表达和定位。结果:成功制备特异性人PIWIL3蛋白多克隆抗体。ELISA和Westernblot检测均表明该抗体具有很好的结合能力。肿瘤组织芯片检测到PIWIL3蛋白在人星形细胞神经胶质瘤和脑脊膜瘤胞质中表达。结论:应用内部多肽选择数据库可以得到最佳的多肽免疫原,以区分亚家族中其他有高度序列同源性的蛋白,成功制备出纯度和结合能力均较好的特异性人PIWIL3抗体,对研究人类特定肿瘤的发病具有潜在的应用价值。

PIWIL1在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的:探讨干细胞相关蛋白PIWI样蛋白1(PIWI-like protein-1,PIWIL1)在肝细胞癌组织中的表达及临床意义,并探索其表达与患者预后的关系.方法:应用免疫组织化学检测47例肝细胞癌标本中PIWIL1的表达,免疫印迹(Western blot)法检测31例肝细胞癌组织中PIWIL1的表达,分析PIWIL1表达与临床特征及预后的关系.结果:PIWIL1在肝癌组织中高表达,在正常肝组织中低表达,PIWIL1同肿瘤分化程度、有无临近组织侵犯有关,与肿瘤大小及甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)水平无关;其阳性表达预示患者预后较差.结论:PIWIL1的高表达同病理分化程度、临近组织侵犯相关及患者预后相关.

Piwil2调控宫颈癌细胞恶性生物学行为的机制探讨

背景与目的:Piwil2在肿瘤干细胞及癌前干细胞中高表达,通过转录和转录后调控机制调控多种基因表达,与肿瘤发生、发展密切相关。该研究探讨Piwil2与宫颈癌细胞恶性生物学行为之间的关系及可能的调控机制。方法:构建慢病毒载体p Lenti-CMV-Piwil2-SV40-EGFP和sh Piwil2质粒,分别转染He La和Si Ha细胞,建立过表达/沉默Piwil2表达稳转细胞株,反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)及蛋白[质]印迹法(Western blot)鉴定转染效果;采用CCK-8法检测细胞增殖能力;PI染色后,流式细胞术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)检测细胞周期;Western blot检测细胞增殖及周期相关调控蛋白表达;采用维拉帕米(verapamil)处理细胞,Hoechst 33342染色,FACS检测侧群(side polulation,SP)细胞比例;CCK-8法检测顺铂对细胞的杀伤活性。结果:过表达Piwil2上调He La和Si Ha细胞S期及G2/M期细胞比例,进而促进细胞增殖,与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);沉默Piwil2表达则细胞发生G0/G1期阻滞,抑制细胞增殖(P<0.05);Piwil2上调cyclin D1表达,提高Stat3磷酸化水平,下调p53表达;Piwil2显著上调He La和Si Ha细胞中SP细胞比例(P<0.01),提高宫颈癌细胞对顺铂的耐药性(P<0.01);沉默Piwil2则相反,显著提高对顺铂的敏感性。结论:Piwil2上调SP细胞比例,促进宫颈癌进展;Piwil2可作为宫颈癌的潜在治疗靶点。

人膀胱癌组织中肿瘤干细胞样细胞的分离培养及PIWIL2表达

目的从人膀胱移行细胞癌(BTCC)组织中分离培养肿瘤干细胞样细胞(CSLC),鉴定其生物学特性,并研究PIWIL2在CSLC中的表达和意义。方法收集12例不同临床分期BTCC患者组织标本,通过酶消化和原代培养相结合等方法处理,采用无血清悬浮培养法分离培养获得含CSLC的悬浮细胞球,流式细胞仪检测细胞表面分子标志CD133和CD44的表达,免疫磁珠分选系统分离CD133+CD44+细胞;采用半定量逆转录聚合酶链反应检测PIWIL2mRNA在CSLC中的表达;裸鼠皮下接种CS-LC,观察其成瘤能力。结果成功地从人膀胱癌组织分离培养获得可悬浮生长、稳定传代的CSLC,CSLC高表达CD133和CD44,裸鼠皮下接种1×104、1×105个CSLC均可全部成瘤,PIWIL2mRNA在CSLC的表达显著高于正常膀胱组织细胞。结论采用无血清悬浮培养法成功从人膀胱癌组织中分离获得CSLC,具有肿瘤干细胞特性,能高度表达PIWIL2,为靶向肿瘤干细胞的治疗提供了实验依据。

鸡Piwil1基因启动子区转录调控元件的初步分析

旨在确定Piwil1基因核心启动子活性调控区,预测转录因子结合位点,并探讨转录因子对家禽Piwil1基因核心启动子活性的影响。通过将Piwil1基因启动子系列缺失片段插入到pGL3-basic载体,构建重组体质粒,将重组体分别转染COS-7和GC-1细胞系,使用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定Piwil1基因核心启动子活性调控区,并对调控区进行转录因子结合位点预测;对预测的转录因子NF-Y结合位点进行定点突变,构建重组体质粒,并通过双荧光素酶报告基因检测系统分析其对启动子活性的影响。狼山鸡Piwil1基因的-1 377^-268bp区域在COS-7和GC-1细胞中都有不同程度的启动活性,-221^+1bp启动子活性几乎完全丧失,在-268^-221bp区域有转录因子NF-Y结合位点,定点突变后启动子活性显著下降,认为转录因子NF-Y对启动子活性可能起着重要的调控作用。转录因子NF-Y为Piwil1基因核心启动子区的重要调控元件,为进一步研究Piwil1基因的转录调控机制奠定了理论基础。

恒河猴piwil4基因的鉴定与表达分析

为了研究人类近亲恒河猴中PIWI家族蛋白PIWIL4的结构和表达情况,文章首次利用同源比对和RT-PCR方法克隆了恒河猴piwil4基因,检测了其mRNA在恒河猴心脏、脑、结肠、附睾和睾丸5种组织中的表达情况,利用生物信息学的方法对恒河猴piwil4基因和人的PIWIL4(HIWI2)基因编码的蛋白产物进行了同源性分析和结构域分析,并进一步利用免疫组化的方法比较了PIWIL4蛋白在成人、成年恒河猴和性未成熟恒河猴睾丸组织中的表达分布。结果表明,恒河猴piwil4 mRNA在多组织中表达,恒河猴和人的PIWIL4蛋白的氨基酸序列同源性达97%以上,均含有PAZ和Piwi结构域,它们在两物种成年个体睾丸组织中空间分布一致,但在不同发育阶段恒河猴睾丸组织中的分布发生了改变,幼猴中PIWIL4蛋白主要表达于生精小管细胞的细胞核,在成年猴睾丸组织中则表达于各种细胞的胞浆中。上述结果提示,piwil4基因在人类和恒河猴精子发生过程中作用类似,PIWIL4蛋白在幼猴和成年猴睾丸组织中的表达差异提示它们在不同发育阶段功能的改变。

舌鳞癌组织中肿瘤干细胞的分离培养及PIWIL4对其的影响

目的从人舌鳞癌组织中分离培养肿瘤干细胞细胞(CSC),鉴定其生物学特性,并研究PIWIL4在CSC中的表达和意义。方法收集9例不同临床分期舌鳞癌患者组织标本,通过酶消化和原代培养相结合等方法处理,采用无血清悬浮培养法分离培养获得含CSC的悬浮细胞球,流式细胞仪检测细胞表面分子标志CD133和CD44的表达,免疫磁珠分选系统分离CD133+CD44+细胞;采用半定量逆转录聚合酶链反应检测PIWIL4 mRNA在CSC中的表达;裸鼠皮下接种CSC,观察其成瘤能力。结果成功的从人舌鳞癌组织分离培养获得可悬浮生长、稳定传代的CSC,CSC高表达CD133和CD44,裸鼠皮下接种1×104、1×105个CSC均可全部成瘤,PIWIL4 mRNA在CSC的表达也显著高于正常舌组织细胞。结论采用无血清悬浮培养法成功从人舌组织中分离获得CSC,具有肿瘤干细胞特性,能高度表达PIWIL4,为靶向肿瘤干细胞的治疗提供了实验依据。

Piwil1基因在鸡生殖系干细胞中的表达研究

为了探讨Piwil1基因在鸡生殖系干细胞中的生物学功能,本研究以原始生殖细胞和精原干细胞为细胞模型,利用Real-time qPCR技术检测了Piwil1基因在如皋黄鸡生殖系干细胞中的相对表达量。结果表明,Piwil1基因在生殖系细胞中特异性表达,且Piwil1基因在精原干细胞中的表达量显著高于原始生殖细胞,这表明Piwil1基因可能在精原干细胞的"DNA重新甲基化"以及自我更新过程中发挥重要作用。

Piwil2、Bcl-2在乳腺恶性叶状肿瘤组织中的表达及相关性

目的通过检测干细胞蛋白Piwil样蛋白2(Piwil2)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)在乳腺恶性叶状肿瘤患者肿瘤组织中的表达,对二者在乳腺恶性叶状肿瘤组织中的表达情况与相关性进行分析。方法选取2010年9月至2015年10月中国人民解放军陆军第81集团军医院确诊的乳腺恶性叶状肿瘤患者30例作为乳腺恶性叶状肿瘤组,另选取同期32例乳腺纤维腺瘤患者作为对照组。免疫组化法检测乳腺恶性叶状肿瘤组和对照组肿瘤组织中Piwil2、Bcl-2的表达情况,分析Piwil2、Bcl-2表达的相关性及两者与乳腺恶性叶状肿瘤临床病理参数之间的关系;分析Piwil2、Bcl-2表达与患者术后复发的关系;使用COX回归分析影响乳腺恶性叶状肿瘤术后复发的因素。结果Piwil2、Bcl-2在恶性叶状肿瘤组中的阳性率均明显高于对照组(P<0.05)。乳腺恶性叶状肿瘤组织中Piwil2、Bcl-2的表达具有一定关系(P<0.05)。有淋巴结转移的乳腺恶性叶状肿瘤组织中Piwil2、Bcl-2阳性率分别高于无淋巴结转移的乳腺恶性叶状肿瘤组织(P<0.05)。Piwil2、Bcl-2阳性表达患者术后复发率明显高于对应的阴性表达患者(P<0.05)。COX多因素分析发现,淋巴结转移、Piwil2阳性表达和Bcl-2阳性表达均是影响患者术后复发的独立危险因素(P<0.05)。结论乳腺恶性叶状肿瘤患者肿瘤组织中Piwil2、Bcl-2阳性率明显升高,二者表达与患者临床特征及术后复发有关。

Piwil2蛋白在乳腺恶性叶状肿瘤组织中的表达及临床预后分析

目的:探讨Piwil2蛋白在乳腺恶性叶状肿瘤组织中的表达,分析Piwil2蛋白的表达与乳腺恶性叶状肿瘤相关临床病理因素之间的关系及对病人10年生存预后的影响。方法:收集乳腺恶性叶状肿瘤女性病人资料50例,同时选取因乳腺炎切除的乳腺正常组织70例作为对照组。采用免疫组织化学法分别检测Piwil2蛋白在乳腺恶性叶状肿瘤、正常乳腺组织中的表达。结果:Piwil2蛋白在乳腺恶性叶状肿瘤组织中的阳性表达率为86.00%,明显高于正常乳腺组织的0.00%,差异有统计学意义(χ^(2)=93.82,P<0.01)。Piwil2蛋白的阳性表达率与病人肿瘤直径≥10 cm、Ki-67≥25%、瘤细胞异型性、CyclinD1蛋白阳性表达及核分裂≥15个/10HPF有关(P<0.05~P<0.01),而与病人年龄及术后是否复发无关(P>0.05)。乳腺恶性叶状肿瘤Piwil2蛋白阳性表达的病人10年生存率(65.12%)低于Piwil2蛋白阴性表达病人(100.00%),差异有统计学意义(χ^(2)=3.95,P<0.05)。结论:Piwil2蛋白的异常表达参与了乳腺恶性叶状肿瘤的演变、发展,也可作为临床预测病人生存预后的参考指标。

Piwil2在三阴性乳腺癌中的表达及临床意义分析

目的:探讨Piwil2在三阴性乳腺癌中的表达及临床意义。方法:收集本校附属医院病理科确诊为三阴性乳腺癌的40例患者作为观察组,另选40例非乳腺癌患者作为对照组,对所有患者的Piwil2表达情况进行比较,并对Piwil2在不同病理分期三阴性乳腺癌中的表达进行观察。结果:Piwil2在三阴性乳腺癌中的阳性表达率为82.50%,对照组为7.50%,差异有统计学意义(P<0.05),TNM分期越高,患者Piwil2阳性表达率越高;Pearson相关性分析显示,Piwil2与三阴性乳腺癌TNM分期呈正相关(r=0.756,P<0.05)。结论:Piwil2与三阴性乳腺癌的肿瘤细胞生长增殖呈正相关,可为有效分子靶向治疗乳腺癌提供参考依据。

Piwil2在三阴性乳腺癌中的表达及与临床分期、肿瘤直径及淋巴结转移的关系

目的探讨Piwil2在三阴性乳腺癌(TNBC)中的表达及与临床分期、肿瘤直径及淋巴结转移的关系。方法从选取2016年3月至2018年3月在湖南中医药大学第一附属医院治疗的40例患者为研究对象,对其进行Piwil2检测,观察不同临床分期、肿瘤直径及淋巴结转移患者的Piwil2表达情况。结果40例中Piwil2阳性率为70.00%。不同临床分期的TNBC患者Piwil2表达有明显差异(P<0.05);肿瘤直径越大、淋巴结转移患者的Piwil2阳性表达率明显较高(P<0.05)。结论TNBC的Piwil2阳性表达率较高,且随着临床分期越高、肿瘤直径越大、淋巴结转移,其阳性率表达率越高。