Pladienolide B对牛胚胎干细胞多能性相关基因表达及细胞活力的影响

【背景】牛胚胎干细胞(bovine embryonic stem cells,BESCs)因具备较高的多能性,在牛品种保存、品种选育及研究家畜胚胎发育调控机制方面具有重要的应用价值。然而,BESCs多能性维持及分化调控的研究相对缺乏,很多机制仍不清楚。【目的】探究不同浓度Pladienolide B(PlaB)对BESCs多能标记基因、全能标记基因、胚胎细胞谱系基因表达及细胞活力的影响,为提高BESCs多能性提供参考和理论依据。【方法】利用免疫荧光检测牛BESCs多能标记基因的表达,利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测不同浓度PlaB对BESCs剪接体、全能标记基因及胚胎细胞谱系基因表达的影响,利用RT-qPCR和Western Blot分别检测不同浓度PlaB对BESCs多能标记基因mRNA和蛋白表达的影响,利用CCK8和EDU染色检测不同浓度PlaB对BESCs增殖的影响。【结果】RT-qPCR结果显示,PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时显著下调EPSCM-BESCs中SF3B1和SF3B2的mRNA表达水平;PlaB浓度为1.5nmol·L^(-1)时,CTFR-BESCs中SF3B1和SF3B2的mRNA表达下降;PlaB浓度范围为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时,CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs的SF3B4和SF3B5的mRNA表达水平呈剂量依赖性增加。此外,PlaB显著下调CTFR-BESCs中SF3B6的mRNA表达。PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时,EPSCM-BESCs和CTFR-BESCs中剪接体LSM4的mRNA表达显著下调。PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时,显著下调CTFR-BESCs的EFTUD2 mRNA表达水平;PlaB浓度为1—1.5 nmol·L^(-1)时能显著下调BEPSCM-BESCs的EFTUD2 mRNA表达水平。浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)范围内,PlaB均以剂量依赖性上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能标记基因OCT4、SOX2及NANOG的mRNA表达水平和蛋白水平。在PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)范围内,PlaB以剂量依赖性上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中全能标记基因MDM2、PID1及BTG2的mRNA表达水平,而下调DDIT4和PDRG1的mRNA表达水平。CTFR-BESCs中添加PlaB均上调胚胎细胞谱系基因的表达,而EPSCM-BESCs中添加PlaB显著降低GATA4、GATA6、SOX7等胚胎细胞谱系基因的表达,但是对于ZIC1没有显著影响。随着PlaB剂量增加和处理时间延长,CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs细胞活力均呈下降趋势,但CTFR-BESCs比EPSCM-BESCs更敏感。【结论】PlaB显著上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能标记基因和部分全能标记基因的表达;降低EPSCM-BESCs中胚胎细胞谱系基因的表达和细胞活力。PlaB对两种BESCs发挥作用的浓度及对基因表达的影响并不完全一致。由于PlaB降低BESCs的细胞活力,仍需要进一步研究以优化培养体系。