乳酸菌细菌素plantaricin JK的异源表达、分离纯化及抗菌活性

为获得高产双肽细菌素plantaricin JK,通过PCR扩增获得pln J和pln K基因,构建表达载体p ET32a(+)-pln J-BL21(DE3)和p ET32a(+)-pln K-BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,利用镍亲和层析柱进行分离纯化,重组蛋白经肠激酶酶切纯化后,细菌素pln J和pln K的产量分别为2~3、5~8 mg·L-1。利用牛津杯平板抑菌法研究抗菌活性,结果显示细菌素pln J和pln K对柠檬色葡萄球菌(Staphylococcus citreus)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)都有明显抑制作用,且双肽细菌素plantaricin JK的抑菌圈直径大于单独的细菌素pln J或pln K。

Spontaneous Unfolding and Refolding of Plantaricin α-Helix in Molecular Dynamics Simulation

Antimicrobial peptides are promising therapeutic agents in view of increasing resistance to conventional antibiotics. Antimicrobial peptides usually fold in α-helical, β-sheet, and extended/random-coil structures. The α-helical antimicrobial peptides are often unstructured in aqueous solution but become structured on bacterial membrane. The α-helical structure allows the partitioning into bacterial membrane. Therefore it is important to understand the mechanism of unfolding and refolding of α-helical structure in antimicrobial peptides. It is not very easy to obverse and study the process of unfolding and refolding of α-helical antimicrobial peptides because of their rapidity. Therefore, molecular simulation provides a way to observe and explain this phenomenon. Plantaricin A is a 26 amino-acid antimicrobial pheromone peptide and can spontaneously unfold and refold under physiological condition. This study demonstrated the unfolding and refolding of plantaricin A by means of molecular simulation, and its mechanism was discussed with its implication to the Levinthal paradox.

植物乳杆菌素plantaricin Q7在牛乳贮藏保鲜中的应用

植物乳杆菌素plantaricin Q7是由植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Q7产生的,其具有广谱抑菌活性的细菌素,有安全、高效、稳定性好等优点.将效价为533 AU∙mL^(-1)的植物乳杆菌素Q7添加到牛乳中,探究其在牛乳贮藏过程中的保鲜效果.结果表明:植物乳杆菌素Q7维持了牛乳良好感官,牛乳贮藏第13天时仍没有异味出现,保持乳白色、略带黄色的状态,无分层和沉淀.荧光假单胞菌是牛乳中的优势嗜冷腐败菌.未添加植物乳杆菌素Q7的牛乳中,荧光假单胞菌落数在第7天超出国标规定;添加植物乳杆菌素Q7将延长荧光假单胞菌落数超出国标规定的时间4 d.植物乳杆菌素Q7有效减缓了牛乳酸度的增加速度,降低了牛乳pH值的下降速度.本研究为植物乳杆菌素Q7的开发与应用提供了依据.

Plantaricin 163对热杀索丝菌的抗菌活性及其作用机制

【背景】热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)为鲫鱼在4°C贮藏过程中的主要腐败菌,Plantaricin 163是由植物乳杆菌产生的一种新型广谱细菌素,能明显延长鲫鱼的贮藏期。【目的】研究Plantaricin163对热杀索丝菌的抗菌活性和作用机制。【方法】通过测定最小抑菌浓度(Minimuminhibitoryconcentration)和杀菌动力学了解Plantaricin163对热杀索丝菌的抗菌效果,并从电导率的变化、核酸和蛋白的泄露、流式细胞实验、扫描电镜和透射电镜观察等4个方面探讨Plantaricin 163对热杀索丝菌的作用机制。【结果】Plantaricin 163对热杀索丝菌的的最小抑菌浓度为32μg/mL,优于Nisin的作用效果,作用方式为杀菌模式,6 h内能完全杀死热杀索丝菌。Plantaricin163能够通过增加热杀索丝菌细胞膜的通透性,增加胞外电导率,进而破坏细胞膜完整性,导致内容物泄漏,并影响细胞的外部形态和内部结构,从而导致菌体细胞瓦解死亡。【结论】Plantaricin 163可以破坏热杀索丝菌的细胞膜和内部结构,发挥抗菌活性。

植物乳杆菌素LPL-1的异源表达及理化性质分析

为在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的Ⅱa类细菌素,以植物乳杆菌素LPL-1为研究对象,将植物乳杆菌素LPL-1的表达基因克隆至阿拉伯糖启动子下,C-端与His-tag序列融合表达,以单核细胞性李斯特菌ATCC 54002为指示菌,鉴定重组细菌素的活性。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对大肠杆菌BW25331基因组进行编辑,突变过氧化物酶基因(ahpC),敲除硫氧还蛋白还原酶(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)基因,成功构建了适宜IIa类细菌素表达的细胞工厂E. coil(ΔtrxB+Δgor+ahpC^(M))。表达产物经亲和层析纯化后,对其理化性质进行分析,证明重组细菌素具有热稳定性(60~100℃)、酸碱稳定性(pH 2~11)、表面活性剂稳定性。本研究实现了植物乳杆菌素LPL-1在大肠杆菌中的活性表达,重组表达的细菌素具有稳定的理化性质,在食品行业具有广泛的应用潜力。

植物乳杆菌ZJ316生产细菌素

【目的】研究植物乳杆菌ZJ316生长和产细菌素的最佳培养基成分和发酵条件,以提高该菌产plantaricin ZJ316的能力。【方法】改变培养基成份和发酵条件,考察不同氮源、碳源等培养基成分和不同的发酵温度等条件对ZJ316生长和产细菌素的影响。【结果】最佳培养基为MRS培养基;优化后的培养基配方为葡萄糖10g/L,麦芽糖10g/L,酵母提取物10g/L,蛋白胨10g/L,柠檬酸三铵2g/L,吐温80为1mL/L,K2HPO4·3H2O6g/L,乙酸钠5g/L,硫酸镁0.2g/L,硫酸锰0.05g/L。培养基初始pH6.5,30℃静置培养24h。【结论】通过培养基成分和发酵条件的优化,细菌素产量提高了2.3倍,为进一步研究和规模化生产奠定基础。

植物乳杆菌素L-1对单核细胞增生李斯特氏菌作用机理的研究

以凝胶层析纯化的植物乳杆菌素作用单核细胞增生李斯特氏菌,结果表明该细菌素可以导致能量化的敏感细胞胞内K+、无机磷离子、乳酸脱氢酶、紫外吸收物质和ATP发生不同程度的泄漏,相应地破坏了膜Δψ和部分ΔpH,引起PMF的耗散,结果导致细胞的死亡。综合所测指标,可以推测植物乳杆菌素L-1对单增李斯特氏菌的作用目标主要是细胞膜,通过形成非选择性孔洞使得选择性离子和小分子生命物质外泄,从而打破原有平衡,最终引起细胞的衰亡。

温度、pH及盐对植物乳杆菌素L-1作用单核细胞增生李斯特氏菌的影响

本试验分析了透析除盐后的植物乳杆菌素L-1的效价和作用方式,测定了在食品加工过程中常涉及到的温度、pH和盐等生化条件对其作用单核细胞增生李斯特氏菌的影响,并初步探索了pH和盐对植物乳杆菌素L-1吸附作用的影响。结果表明:透析除盐后的植物乳杆菌素L-1的效价可达1280AU/ml,作用方式为杀菌;低温下144h内可以控制住初始菌数,高温下可以短时间内迅速降低初始活菌数;在pH7.0下,该细菌素的抑菌效果最好;无论是TSBYE培养基中还是磷酸缓冲液中,试验所采用的四种盐对植物乳杆菌素L-1的杀菌作用都有一定的拮抗作用,各盐之间和同种盐内不同浓度间差异不显著;对吸附作用的初步研究发现pH对植物乳杆菌素的吸附作用有一定影响,而盐对其影响不显著。

植物乳杆菌素L-1对冷却肉的防腐保鲜效果研究

本实验研究了植物乳杆菌素L-1对冷却肉的防腐保鲜效果。实验中对冷却肉的微生物、感官品质和理化指标三方面进行了检测。结果显示,效价320AU/ml组效果与Nisin相近,效价640AU/ml组的效果优于Nisin,通过对照,效价640AU/ml的植物乳杆菌素L-1处理组可将冷却肉的保质期从3d延长至12d。植物乳杆菌素L-1对冷却肉中主要污染菌——假单胞菌和潜在致病菌——单增李斯特菌有较好的抑制效果。植物乳杆菌素L-1作为冷却肉的生物防腐剂,具有广阔的应用前景。

植物乳杆菌fmb10产细菌素发酵条件的优化

通过单因素试验对影响植物乳杆菌fmb10发酵产细菌素的8个影响因子进行初筛,采用Plackett-Burman设计法确定显著影响因子,利用最陡爬坡试验逼近最佳响应面区域,运用Design-Expert软件的中心组合试验设计(central composite design,CCD)对显著影响因子的重要水平和交互作用进行研究。结果表明,菌株fmb10产细菌素的最佳发酵条件为:发酵温度30.38℃、葡萄糖质量浓度21.1 g/L、酵母膏质量浓度11.0 g/L,在此条件下,植物乳杆菌fmb10发酵上清液对大肠杆菌抑菌圈直径平均为22.90 mm,与预测值22.89 mm高度吻合,优化后植物乳杆菌fmb10发酵上清液抑菌圈直径较原始抑菌圈直径(18.37 mm)提高了24.66%。

植物乳杆菌LPL-1产细菌素发酵培养基优化

乳酸细菌素是细胞在转录翻译过程中通过核糖体机制合成,并分泌到菌体体外的一类具有抑菌活性的蛋白质,细菌素具有无抗药性、无毒副作用及易被人体降解的特点,因此是一种天然的食品防腐保鲜剂。为了提高植物乳杆菌LPL-1所产细菌素的产量,以单增李斯特菌为指示菌,相对抑菌效价为效应值,通过响应面法对发酵培养基组成进行优化,确定了最优培养基组成。利用单因素试验与Plackett-Burman试验,确定了主要影响因素为葡萄糖质量分数、胰蛋白胨质量分数与吐温-80体积比,最陡爬坡试验与Box-Behnken响应面试验确定了最优培养基组成为:葡萄糖质量分数2.08%、酵母粉质量分数0.51%、胰蛋白胨质量分数1.02%、牛肉膏质量分数1%、吐温-80体积比1.02 mL/L、磷酸氢二钾质量浓度3 g/L、乙酸钠质量分数0.5%、硫酸镁质量浓度0.2 g/L、硫酸锰质量浓度0.3g/L、柠檬酸氢二铵质量浓度2 g/L、蒸馏水体积1 L。在此条件下细菌素效价(752.11 AU/mL)比优化前(286.67AU/mL)提高了1.62倍。因此,发酵培养基的优化为菌种与细菌素的产业化应用奠定了基础。

响应面法优化植物乳杆菌LPL-1产细菌素发酵条件及细菌素理化性质分析

为提高新型植物乳杆菌LPL-1所产细菌素(植物乳杆菌素LPL-1)的产量,以单核细胞性李斯特菌为指示菌,相对抑菌效价为响应值,通过响应面法对发酵条件进行优化,确定了最优发酵条件。利用单因素试验与Plackett-Burman试验,确定主要影响因素为温度、发酵时间与初始pH值,通过最陡爬坡试验与Box-Behnken响应面试验,确定最优发酵条件为发酵温度31℃、培养基初始pH 6.40、发酵时间32 h、接种量0.5%、装液量60%,在此条件下细菌素效价(674.29 AU/mL)比优化前(292.02 AU/mL)提高了1.31倍。通过对细菌素理化性质的分析,证明了细菌素具有热稳定性(100℃,30 min)、酸碱稳定性(pH 2～10)、蛋白酶敏感性与抑菌性,同时利用二硫键变性剂对细菌素结构中的二硫键进行变性处理,证明二硫键对其抑菌特性的重要性。因此,通过细菌素发酵条件的优化与理化性质的分析,为菌种与细菌素的产业化生产与应用提供了理论支持。

植物乳杆菌共培养诱导产细菌素基因座的遗传分析

通过共培养诱导产生细菌素,成功筛选到两株植物乳杆菌XJ25和PC520。基于两株菌基因组重测序,分析其植物乳杆菌素(plantaricin,pln)基因座间存在的差异。结果:菌株XJ25和PC520的pln基因座结构相似,均由6个操纵子(plnEFI、plnJKLR、plnGHSTUVW、plnABCD、plnMNOP、plnWXY)组成,其中plnABCD是3组分调节操纵子。菌株XJ25和PC520均存在一个新的未知功能的orf1;菌株PC520的部分基因(plnY,plnS)等缺失,菌株XJ25的plnF基因编码蛋白在14位(A-S)和42位(V-I)有两个氨基酸突变。

植物乳杆菌素抑菌机理的研究

从植物乳杆菌B-28的代谢产物中分离纯化植物乳杆菌素,以蜡样芽胞杆菌为指示菌,通过测定指示菌细胞结构和细胞中APT、离子量的变化,分析探讨植物乳杆菌素的抑菌机理。研究结果表明:当植物乳杆菌素作用于蜡样芽胞杆菌时,胞内ATP呈现迅速下降趋势;并迅速释放出K+和Na+,而且植物乳杆菌素的质量分数与K+和Na+释放量基本呈现线性正相关。随着植物乳杆菌素添加量的增加,蜡样芽胞杆菌细胞裂解率在逐渐提高。而且电镜观察发现:植物乳杆菌素作用的蜡样芽胞杆菌的细胞壁边缘模糊,菌体细胞变形,部分细胞壁缺失,可看到胞内物质的损失。

植物乳杆菌163产抗菌物质的发酵条件优化

本文优化了从泡菜中发现的一株植物乳杆菌163产植物乳杆菌素的发酵条件,并通过单因素实验、PlackettBtmnan实验、Box-Behnken实验的响应面方法得到的最佳的发酵培养基为:麦芽糖浆55 g/L,玉米浆干粉20 g/L,乙酸钠8 g/L,柠檬酸氢二铵6 g/L,吐温-80 1.26 g/L,发酵条件:初始p H4.7,接种量为2%。最终抑菌圈直径提高到了31.90 mm,比原来的MRS培养基发酵提升了1.10倍。本次优化不仅提升了发酵液的抑菌活性,并且获得了一种成本低廉的可以大规模应用的食品级培养基配方。

Lactobacillus plantarum subsp.plantarum YM-4-3植物乳杆菌素编码基因座遗传分析(英文)

对从云南传统发酵豆豉分离得到的Lactobacillus plantarum subsp.plantarum YM-4-3菌株所编码的植物乳杆菌素基因座进行遗传分析研究.研究结果表明该植物乳杆菌素基因座由22 481个核苷酸组成,包括plnEFI,plnRLJK,plnABCD,plnMNOP,plnGHSTUVW 5个操纵子,分别涉及植物乳杆菌素生物合成、免疫、调控和转运功能.该菌株所编码的植物乳杆菌素基因座与先前报道的L.plantarum C11相类似,然而由于该菌株所编码的plnH基因缺失一个核苷酸,最终导致读码框移位,终止密码子提前出现,从而致使所表达的plnH蛋白丧失相应功能.由于转运操纵子plnGHSTUVW高度保守,目前尚未有该操纵子内plnH功能缺失的相关报道.plnH基因编码ABC转运蛋白的辅助蛋白,但是该蛋白在植物乳杆菌素生物合成中所担当的功能尚未明确.YM-4-3菌株可以作为plnH蛋白缺失模式菌株,进一步研究其该基因在植物乳杆菌素生物合成中的相关功能.

广谱抑菌作用的植物乳杆菌素LPC718特性的研究

为了探明植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LPC718所产细菌素plantaricin LPC718的特性,采用双层平板法测定了细菌素对酸、热和蛋白酶的敏感性、抑菌谱和作用方式;并采用硫酸铵沉淀和Sephadex G-25凝胶层析方法对活性物质进行了初步的纯化。研究表明plantaricin LPC718在p H3~5.5范围内具有抑菌活性;经100℃处理30 min后抑菌活力仍保持在80%以上;蛋白酶K、蛋白酶E和脂肪酶可完全破坏其抑菌活性,木瓜蛋白酶和糜蛋白酶可部分破坏其活力,而胃蛋白酶完全没有作用。plantaricin LPC718不仅对多种革兰氏阳性菌有较强的抑菌作用,更为重要的是对一些革兰氏阴性菌也有较强的抑菌作用。添加plantaricin LPC718可使鸡白痢沙门氏菌培养液中活菌数下降,但细胞密度基本维持不变。因而,plantaricin LPC718是一种新的具有广谱抑菌功能的、含脂类成分的细菌素,在酸和热条件下活性稳定,具有杀菌作用但不引起细胞裂解。

植物乳杆菌素合成及其调控机制的研究进展

植物乳杆菌素(plantaricin)是由多个氨基酸组成的多肽类抗菌素。它是一类重要细菌素,具有种类多、抑菌谱广、不易产生耐药性、安全性高等优点,因此在食品、饲料和医药等领域有潜在应用价值。然而,因植物乳杆菌素产量低而影响了其在食品和医药中的应用。本文从植物乳杆菌素种类、群体感应系统及植物乳杆菌素基因簇等方面介绍植物乳杆菌素诱导及调控的最新研究进展。

植物乳杆菌素M1-UVs301阳离子交换法分离纯化的研究

实验采用阳离子交换层析技术分离纯化植物乳杆菌素M1-UVs301。结果表明,植物乳杆菌素M1-UVs301分离纯化后在250~320 mL活性突出,精度纯化后在11~13 mL具有抑菌活性。纯化后植物乳杆菌素M1-UVs301比活力显著增加至26 321 AU·mg-1,蛋白凝胶上条带单一明显,在3.4 kDa左右抑菌活性显著。氨基酸及蛋白结构分析结果表明,该植物乳杆菌素M1-UVs301为一种疏水肽,二级结构中β-折叠含量较高,为其后续结构和特性的进一步分析提供基础。

乳酸菌素基因PlnE和PlnF在大肠杆菌中的异源表达

为获得高产量纯品植物乳杆菌素PlnE和PlnF,研究其开发生物兽药的可能,试验通过人工合成植物乳杆菌素基因PlnE和PlnF,构建表达载体pGEX-4T-E和pGEX-4T-F,经IPTG诱导表达条件优化后,进行亲和层析纯化融合表达蛋白,并使用SDS-PAGE进行鉴定。试验结果表明,pGEX-4T-E和pGEX-4T-F构建成功,纯化后获得2种产量高达30%的纯品融合蛋白,SDS-PAGE鉴定两融合蛋白表达正确。说明PlnE和PlnF基因片段编码的多肽能在原核细胞中正确表达,为进一步研究该细菌素的生物活性奠定了基础。