RP4质粒及其带动的硫杆菌重组质粒psDt125在氧化硫硫杆菌中的接合转移

本实验选择了一种大肠杆菌(E.coli)和氧化硫硫杆菌(Thiobacillusthiooxidans)均能生长的接合培养基。以大肠杆菌E.coli C600(RP4)为供体,以氧化硫硫杆菌T.t-3为受体,通过接合,直接将RP4质粒转移到氧化硫硫杆菌中,其Km^r,Tc^r基因得到表达,但Ap^r基因不表达。再将RP4质粒反向接合转移到E.coliHB101上,其三个抗性基因均表达。并且利用RP4质粒的带动将硫杆菌重组质粒psDt125直接转入氧化硫硫杆菌,其Cm^r基因表达。从而为氧化硫硫杆菌的基因工程改造提供了一条简便可行的遗传信息转移途径。

抗生素单一及联合暴露对RP4质粒介导的抗性基因水平转移的hormesis效应研究

抗生素滥用导致的抗性基因(ARGs)泛滥问题引起人们的日益关注。目前关于抗性基因的研究主要集中在环境监测方面,但是关于抗生素对ARGs传播的影响研究还相对缺乏。质粒是ARGs传播的重要载体,因此以基于RP4质粒的大肠杆菌(E.coli)接合转移体系为研究对象,探讨了盐酸四环素、甲氧苄啶、磺胺氯哒嗪、磺胺异唑在单一暴露条件下对RP4质粒接合转移的影响。根据单一暴露的结果设计混合抗生素的浓度比,探究抗生素联合暴露实验对质粒接合转移的影响。结果表明:在单一暴露条件下,只有盐酸四环素对含有四环素抗性的RP4质粒的接合转移频率有低促高抑的hormesis效应;在联合暴露条件下,对RP4质粒接合转移无促进作用的抗生素会抑制四环素的hormesis效应,这一定程度上降低了抗生素的环境风险。并且用受体理论解释了抗生素对质粒接合转移的hormesis效应产生机制,为目前尚无定论的hormesis受体理论机制提供了证据支持。

离子液体[BMIm][PF6]增强抗性质粒RP4介导的接合转移基因mRNA的表达水平

环境中广泛存在的抗生素和抗生素抗性基因会导致很严重的人类健康风险。在我们前期研究中发现,离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF6])作为环境选择性压力可以促进抗生素抗性基因的水平转移。本研究以E.coli DH5α(RP4)和同属的E.coli HB101,以及E.coli DH5α(RP4)和跨属的Salmonella enterica之间的纯菌接合转移体系为考察对象,从mRNA基因表达调控水平角度阐明离子液体[BMIm][PF6](0.001~2.5 g·L-1)影响质粒RP4接合转移的机理。结果表明,离子液体[BMIm][PF6]通过抑制基因kor A,kor B和trb A的mRNA表达水平来提高接合和跨膜转运基因trb Bp和trf Ap的表达;增强水平转移基因tra F的mRNA表达水平,并通过增强负调控基因kil A和kil B的mRNA表达水平抑制质粒的垂直传递过程;通过抑制基因trb K的mRNA表达水平降低接合转移体系的排斥效果,从而促进质粒RP4的接合转移。该结果有助于为抗生素抗性基因在环境中水平转移扩散的机理研究提供理论依据。

荧光原位杂交技术鉴定RP4质粒在序批式反应器活性污泥间的水平转移

目的为RP4质粒在序批式反应器活性污泥间的水平转移提供影像学证据。方法构建正常运行的序批式反应器,通过投加带有RP4质粒的供体菌实现质粒的水平转移。实验组分别用特异性标记氨氧化菌,RP4质粒的寡核苷酸探针进行杂交,再用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染。对照组分别对纯培养的氨氧化菌,携带RP4质粒的供体菌和未投加供体菌的活性污泥进行相同的操作。通过荧光定量PCR技术对RP4质粒相对丰度变化情况进行验证。结果在实验组中发现了探针荧光的共定位现象,而对照组中均未发现荧光共定位现象。荧光定量PCR显示实验组污泥投加供体菌后RP4质粒相对丰度有所提高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RP4质粒可以在正常运行的序批式反应器的活性污泥间发生水平转移。

RP_4质粒转移给鼠疫菌的研究

利用携带ＲＰ＿４质粒的大肠杆菌与鼠疫菌进行转移实验，获得了接合子，证实ＲＰ＿４质粒向鼠疫菌转移频率为１０￣（－６），ＲＰ＿４质粒能随鼠疫菌传代，鼠疫菌所含的６５Ｍｄａｌ、４５Ｍｄａｌ、１３Ｍｄａｌ、６Ｍｄａｌ质粒与ＲＰ＿４质粒相容。未发现ＲＰ４质位诱动鼠疫菌质粒ＤＮＡ。鼠疫菌自身质粒不能自行转移。