CD8^+调节性T细胞诱导移植免疫耐受的研究进展

免疫耐受是器官移植临床研究的终极目标,是改善移植患者预后生存的关键。调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)在诱导免疫耐受过程中发挥着重要作用,如何诱导供体产生特异性Tregs是诱导免疫耐受突破的关键。尽管近20年来已经证实CD8^+Tregs在移植诱导免疫耐受中发挥重要的作用,但其特性仍然存在很大的争议。本文拟对CD8^+Tregs移植免疫耐受研究进展作一综述,探讨其在诱导肝移植免疫耐受中的潜力。

PbTIP多克隆抗体对恶性疟原虫生长抑制作用的初步研究

首先构建了伯氏疟原虫TIP样蛋白(以下简称PbTIP)的原核表达载体pET32a/PbTIP,在大肠杆菌中成功诱导表达了带His标签的PbTIP融合蛋白。SDS-PAGE分析显示该融合蛋白主要以包涵体形式表达。Western-Blot鉴定虽然证明该融合蛋白表达正确,但即便在变性条件下该蛋白的亲和层析纯化效果也不佳。以PbTIP融合蛋白经过初次和三次加强免疫获得的小鼠PbTIP多克隆抗体滴度达到1∶105以上。进一步的研究表明,小鼠PbTIP抗血清对体外培养恶性疟原虫的生长具有一定的抑制作用,这显示PbTIP多克隆抗体对恶性疟原虫感染具有一定的交叉保护作用。以上实验结果为后续PbTIP在疟原虫免疫抑制中的功能及其机制研究奠定了一定的基础。

创伤后活化T细胞内cAMP代谢、蛋白激酶A活性的变化及意义

研究了创伤小鼠活化Ｔ细胞内ｃＡＭＰ代谢、蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）活性的变化及同Ｔ细胞功能的关系。结果显示，创伤后活化Ｔ细胞内ｃＡＭＰ含量增加，这一变化同创伤后Ｔ细胞白介素２（ＩＬ－２）生成减少，ＩＬ－２受体（ＩＬ－２Ｒ）表达受抑，Ｔ淋巴细胞转化（ＴＬＴ）降低密切相关。创伤后活化Ｔ细胞内腺苷酸环化酶（ＡＣ）、ＰＫＡ活性增加，ｃＡＭＰ－磷酸二酯酶（ｃＡＭＰ－ＰＤＥ）活性降低。ＰＫＡ抑制剂Ｈ－８在体外可明显逆转创伤小鼠Ｔ细胞功能的受抑状态。提示ｃＡＭＰ－ＰＫＡ途径参与了创伤后Ｔ细胞功能的抑制过程。ＡＣ活性增加、ｃＡＭＰ－ＰＤＥ活性降低是导致Ｔ细胞内ｃＡＭＰ含量增加的原因。

华支睾吸虫TIP-C基因的序列分析及原核表达

华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)是一种重要的人兽共患病原,T细胞免疫调节蛋白(TIP)存在于该虫体生长发育的各个阶段,能够抑制T细胞免疫应答,有助于虫体在宿主体内寄生。为了解华支睾吸虫TIP蛋白的生物信息学及原核表达该蛋白,本研究利用DNAStar软件对GenBank中华支睾吸虫TIP基因编码蛋白的生物信息学进行分析,结果显示华支睾吸虫TIP蛋白表面具有较丰富的B细胞抗原表位且集中在其C段(CsTIP-C),具有多个α-螺旋和β-折叠。采用RT-PCR扩增CsTIP-C片段,构建pET-22b-CsTIP-C重组质粒,经双酶切及测序鉴定后,转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后SDS-PAGE检测该蛋白的表达情况,获得的重组蛋白经切胶纯化后进行western blot鉴定。PCR扩增及测序结果显示,扩增得到的CsTIP-C为930 bp,编码309个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,CsTIP-C在33 ku处有目的蛋白条带,western blot结果表明该重组蛋白具有良好的反应原性。本研究首次完成了CsTIP-C的克隆表达,并证明该蛋白具有反应原性,为华支睾吸虫病免疫诊断试剂盒的研发奠定了基础。

麦粒灸对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠Th1/Th2平衡及转录因子T-bet、GATA3的影响

目的观察麦粒灸对化学治疗诱导的免疫抑制小鼠Th1细胞(Th1)/Th2细胞(Th2)平衡及转录因子T盒子转录因子(T-bet)、GATA结合蛋白3(GATA3)的影响。方法32只SPF级雄性CD-1(ICR)小鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、盐酸左旋咪唑组、麦粒灸组,每组8只。除正常组外,其他各组小鼠腹腔注射环磷酰胺(80 mg/kg,每日1次,连续3 d)制备免疫抑制小鼠模型。盐酸左旋咪唑组小鼠灌胃盐酸左旋咪唑溶液(10 mg/kg);麦粒灸组小鼠灸“关元”、双侧“足三里”、双侧“三阴交”,每穴3壮,每壮约30 s。每日1次,连续7 d。观察小鼠一般情况;检测脾脏质量及脾脏指数;HE染色法观察脾脏组织病理;蛋白质印迹法和实时荧光PCR法检测小鼠脾脏组织T-bet、GATA3、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-4蛋白及mRNA表达;酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4含量。结果与正常组比较,模型组小鼠反应迟钝、步态不稳;脾脏质量及脾脏指数增加(均P<0.05);脾脏组织结构紊乱,脾脏组织T-bet、IFN-γmRNA及蛋白表达下降,GATA3、IL-4 mRNA及蛋白表达升高(均P<0.05);血清IFN-γ、IL-2含量减少,IL-4含量增加(均P<0.05)。与模型组比较,盐酸左旋咪唑组和麦粒灸组小鼠一般情况好转,脾脏组织结构改善,脾脏组织T-bet、IFN-γmRNA及蛋白表达下降,GATA3、IL-4 mRNA及蛋白表达升高(均P<0.05);血清IFN-γ、IL-2含量减少,IL-4含量增加(均P<0.05)。结论麦粒灸对化学治疗诱导的免疫抑制症状具有改善作用,其机制可能是调节转录因子T-bet、GATA3的表达,调节Th1/Th2平衡,从而恢复免疫平衡状态。

小鼠B7H1-Ig融合蛋白诱导免疫抑制的机制研究

为了探讨小鼠B7H1-Ig融合蛋白诱导免疫抑制的机制,应用抗CD3抗体协同B7H1-Ig融合蛋白刺激纯化的CD4+T细胞,检测其增殖效应和培养上清细胞因子水平的变化,并观察B7H1-Ig对不同品系小鼠混合淋巴细胞反应的抑制作用。发现B7H1-Ig有引起T细胞先增殖后抑制的现象,其抑制作用通过IL-10、TGF-β和受体PD-1,并有调节性T细胞的参与。研究为B7H1-Ig进一步应用于临床疾病的免疫调控打下基础。

蛋白激酶C-θ在免疫中的研究进展

蛋白激酶C(PKC)家族经第二信使钙离子、甘油二酯或磷脂酰丝氨酸激活,通过不同的信号通路来发挥特定效应。近年的研究表明,蛋白激酶C-θ(PKC-θ)的激活与表达不但与免疫有关,而且与某些相关疾病的诱发也有联系。因此,研发与PKC-θ相关的免疫抑制剂,既可用于器官移植排斥反应又可治疗自身免疫病。本文就PKC-θ在T细胞受体(TCR)信号通路及淋巴细胞中的作用、免疫相关疾病、免疫抑制剂等最新研究进展综述。

胰腺癌中ANGPTL2蛋白与免疫抑制细胞浸润的关系及临床意义

目的:研究胰腺癌血管生成样蛋白2(ANGPTL2)表达与免疫抑制细胞[髓系来源抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)、M2巨噬细胞]浸润数量的相关性,并分析ANGPTL2蛋白、MDSC、Treg和M2巨噬细胞与临床病理特征关系。方法:收集2019年1月至2022年3月手术切除的胰腺癌组织标本及其癌旁正常组织(距癌灶边缘3~5 cm)标本各94例。以实时荧光定量PCR测定ANGPTL2 mRNA表达;免疫组织化学法检测免疫抑制细胞。采用统计学软件SPSS 25.0进行处理,ANGPTL2 mRNA表达等计量资料以(xˉ±s)表示,采取配对样本t检验;癌组织ANGPTL2 mRNA表达及癌组织免疫抑制细胞浸润数量与病理特征关系分析,采用独立样本t检验或单因素方差分析,二者相关性分析采用Pearson相关性检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果:胰腺癌组织中ANGPTL2 mRNA表达水平及MDSC、Treg、M2巨噬细胞浸润数量较癌旁组织明显升高(P<0.05);胰腺癌组织中ANGPTL2 mRNA表达及免疫抑制细胞数量与分化程度、TNM分期、淋巴结转移等病理特征有关(P<0.05),二者呈正相关(r_(1)=0.786,r_(2)=0.752,r_(3)=0.861,P均<0.05)。结论:胰腺癌组织中ANGPTL2表达与免疫抑制细胞浸润数量均明显升高,且两者具有显著的正相关性,并与胰腺癌恶性程度及肿瘤转移有关。ANGPTL2可能通过调节免疫抑制细胞浸润,介导肿瘤细胞免疫逃逸,促进肿瘤细胞侵袭转移,从而诱导胰腺癌的发生发展。

隔药饼灸对免疫抑制兔Tim-4及PD-1的泛素化的影响

目的:观察隔药饼灸对免疫抑制兔巨噬细胞效应分子T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-4(Tim-4)及细胞程序性死亡受体1(PD-1)泛素化的影响,探讨隔药饼灸改善免疫抑制的可能机制。方法:将32只大耳白兔随机分为空白组、模型组、艾条灸组及隔药饼灸组,每组8只。除空白组外,其余3组均以60 mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺制备免疫抑制模型。艾条灸组予艾条灸,每穴灸1壮;隔药饼灸组予隔药饼灸,每穴灸5壮。均选取“神阙”“肾俞”“足三里”等穴,隔日1次,共干预10次。采用血细胞分析仪检测外周血白细胞含量;流式细胞术检测外周血PD-1在CD_(4)^(+)、CD_(8)^(+)T淋巴细胞及CD_(68)^(+)巨噬细胞中的阳性表达;ELISA法检测血清白细胞介素2(IL-2)、CD8、CD68及Tim-4含量;免疫组化法检测肝脏、脾脏Tim-4及F-box蛋白38(FBXO38)表达。结果:与空白组比较,模型组外周血白细胞计数(WBC)及中性粒细胞百分比(NEU%)降低、淋巴细胞百分比(LYM%)升高(P<0.01);外周血PD-1在CD_(4)^(+)、CD_(8)^(+)T淋巴细胞及CD_(68)^(+)巨噬细胞中的阳性表达率升高(P<0.01);血清IL-2、CD68及Tim-4含量升高(P<0.01),CD8含量降低(P<0.01);肝脏Tim-4及肝脏、脾脏FBXO38平均吸光度值增高(P<0.01)。与模型组比较,艾条灸组与隔药饼灸组WBC及NEU%升高(P<0.01);外周血PD-1在CD_(4)^(+)、CD_(8)^(+)T淋巴细胞及CD_(68)^(+)巨噬细胞中的阳性表达率降低(P<0.01);血清IL-2、CD68与Tim-4含量降低(P<0.01),CD8含量升高(P<0.01);肝脏Tim-4、FBXO38及脾脏FBXO38平均吸光度值降低(P<0.01,P<0.05)。与艾条灸组比较,隔药饼灸组外周血PD-1在CD_(68)^(+)巨噬细胞中的阳性表达率升高(P<0.05);血清Tim-4含量增高(P<0.01);肝脏Tim-4平均吸光度值降低(P<0.05)。结论:隔药饼灸可通过调节巨噬细胞效应分子Tim-4表达及FBXO38介导的PD-1泛素化改善免疫抑制状态,Tim-4可能是其参与免疫调控的特异性指标之一。

高迁移率族蛋白B1对小鼠调节性T细胞抑制功能的影响

目的观察高迁移率族蛋白B1（HMGB1）对调节性T细胞（regulatoryTcell，Treg）免疫抑制功能的影响，并对其机制进行初步探讨。方法免疫磁珠法分离正常BALB／c小鼠脾脏CD4^＋CD25^＋Treg。采用固相包被抗CD3／可溶性抗CD28及HMGBl刺激的方法，流式细胞术观察HMGB1对抑制性细胞因子T淋巴细胞毒性相关抗原4（CTIA-4）表达的影响，并通过MTT比色试验观察HMGB1刺激对Treg抑制功能的影响。结果经抗CD3／CD28刺激活化的CD4^＋CD25^＋Treg在1000ng／mlHMGB1作用72h时CTLA-4表达下降最明显（P〈0．01）。CD4^＋CD25^＋Treg与CD4^＋CD25^＋Treg细胞比值达1：1时抑制效率达到90％以上，而HMGB1刺激后的CD4^＋CD25^＋Treg对CD4^＋CD25^＋T细胞的抑制功能明显减弱。结论HMGB1可以通过诱导TregCTLA-4表达下调，从而影响Treg免疫抑制活性。

日本血吸虫热休克蛋白60通过诱导CD4^+CD25^+Treg细胞表达IL-10和TGF-β增强其免疫抑制功能

目的探讨日本血吸虫热休克蛋白60(Sj HSP60)增强小鼠CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)免疫抑制功能的可能机制。方法采用体外研究探索Sj HSP60对Treg细胞功能的影响,通过体外细胞增殖实验检测Sj HSP60促进Treg细胞免疫抑制功能增强的途径,利用流式细胞术检测Treg细胞表达IL-10和TGF-β的水平以及Treg细胞Foxp3和CTLA-4表达水平。结果体外实验证实,Sj HSP60可增强Treg细胞的免疫抑制功能(t=6.466,P=0.006);体外细胞增殖实验表明,Sj HSP60刺激后的Treg细胞可通过分泌可溶性细胞因子IL-10(t=7.363,P=0.002)和TGF-β(t=11.262,P=0)发挥免疫抑制功能;流式细胞术检测显示,Sj HSP60刺激后的Treg细胞IL-10(t=12.367,P=0)、TGF-β(t=8.431,P=0.001)、Foxp3(比例:t=5.225,P=0.006;平均荧光强度:t=8.319,P=0.001)和CTLA-4(比例:t=3.518,P=0.024;平均荧光强度:t=4.164,P=0.014)表达水平显著增加。结论 Sj HSP60可通过促进Treg细胞表达IL-10和TGF-β增强其免疫抑制功能,并可能与Sj HSP60诱导Treg细胞表达Foxp3和CTLA-4有关。

PICK1经TGF-β/Nodal信号通路介导RSV感染小鼠的免疫抑制及气道高反应

目的探究蛋白激酶Cα相互作用蛋白1(protein interacting with Cαkinase 1,PICK1)通过TGF-β/Nodal信号通路干预呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染小鼠支气管哮喘(bronchial asthma,BA)模型中免疫抑制及气道高反应的机制研究。方法30只小鼠随机分为3组(n=10),分别为对照组、BA组和FSC231组。BA组和FSC231组通过RSV建立BA模型,FSC231组小鼠同时腹腔注射PICK1抑制剂FSC231干预。通过HE染色观察各组小鼠肺组织病理学变化。通过肺功能仪检测气道阻力,计数肺泡灌洗液中EOS数目。通过酶联免疫吸附法检测IL-17、IL-10和IgE水平。流式细胞术检测血液中Th17和Tregs水平。结果BA组肺泡结构紊乱,支气管狭窄,管壁增厚,出现炎性浸润。FSC231组支气管和肺泡结构严重损坏,并且支气管壁充血、增厚,支气管内阻塞,出现严重的炎性浸润现象。BA组的BALF中EOS计数、血清IgE水平、气道阻力、肺组织Nodal水平、Th17细胞比例和血清IL-17均高于对照组(P<0.05),而FSC231组的BALF中EOS计数、血清IgE水平、气道阻力、肺组织Nodal水平、Th17细胞比例和血清IL-17则高于BA组(P<0.05)。相反,BA组的Treg细胞和IL-10低于对照组(P<0.05),而FSC231组的Treg细胞和IL-10则低于BA组(P<0.05)。结论抑制PICK1可能通过促进TGF-β/Nodal信号通路引起Th17细胞升高和Treg的降低,从而加重免疫抑制,进一步提高BA小鼠气道高反应。

伯氏疟原虫T细胞免疫调节蛋白的表达及其对DC2.4的作用

目的应用原核载体表达PbTIP胞外重组蛋白片段(rPbTIP)并在体外刺激树突状细胞DC2.4,研究在体外PbTIP片段蛋白对DC2.4细胞是否有一定的免疫调节功能。方法用实验室保存的含有pET32a(+)-rPbTIP载体的E.coil BL-21菌株表达并纯化rPbTIP蛋白;然后在体外培养的DC2.4细胞中加入不同浓度的rPbTIP蛋白刺激,应用细胞增殖实验检测rPbTIP对DC2.4细胞是否有促进增殖的作用;对rPbTIP刺激后的DC2.4细胞进行RT-PCR检测,分析DC2.4细胞表面分子MyD88、NF-κB、TLR9、TLR4的mRNA含量变化;rPbTIP刺激DC2.4后,应用ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-10、TGF-β和IFN-γ细胞因子水平。结果成功表达出rPbTIP蛋白,纯化后蛋白浓度为1 mg/mL;1 ng/mL的rPbTIP对DC2.4细胞有一定促进增殖作用,并且细胞培养上清中TNF-α水平明显升高,有统计学意义(P<0.05),其他细胞因子水平变化无统计学意义(P>0.05);100 ng/L的rPbTIP对DC2.4细胞可能有一定抑制作用,并且可以上调DC2.4表面MyD88、NF-κB、TLR9 mRNA含量。结论在体外,rPbTIP蛋白对DC2.4细胞的免疫功能具有一定的调节作用,不同浓度rPbTIP蛋白的作用可能不同,需要进一步研究。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段基因复合核酸疫苗诱导小鼠抗体免疫性的研究

目的 检测以恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1的 17区片段基因为基础的复合核酸疫苗(分泌性的VR10 12 /TPA/HG MSP1 17和非分泌性的VR10 12 /HG MSP1 17)诱导小鼠的体液免疫反应和免疫血清对疟原虫生长的抑制能力。方法 以 2 0 0 μg/10 0 μl或 10 0 μg/10 0 μl每次每只VR10 12 /HG MSP1 17或VR10 12 /TPA/HG MSP1 17肌注免疫BALB/c或C5 7BL/6小鼠。用ELISA间接法测定小鼠血清的特异性抗体 ,用体外抑制试验检测免疫血清抑制疟原虫生长效果。结果 经 3次 10 0 μg/10 0 μl每次每只VR10 12 /HG MSP1 17免疫后 ,BALB/c小鼠和C5 7BL/6小鼠均产生了明显的HG和YMSP119抗体。但总体抗体水平不高。BALB/c小鼠经 3次 2 0 0 μg/10 0 μl每次每只的VR10 12 /HG MSP1 17免疫后 ,产生了较高的HG抗体 ,但MSP1 17的抗体无明显变化 ,经 3次 2 0 0 μg/10 0 μl每次每只VR10 12 /TPA/HG MSP1 17免疫后 ,仅产生较低的HG抗体 ,无MSP1 17抗体的产生。用 2 0 0 μg/10 0 μlVR10 12 /HG MSP1 17免疫的BALB/c小鼠血清做体外抑制试验 ,结果抑制效果明显。结论 VR10 12 /HG MSP1 17比VR10 12 /TPA/HG MSP 17具有更强的免疫原性 。