微流控芯片技术和流式细胞术检测替格瑞洛抗血小板疗效

目的应用微流控芯片技术和流式细胞术体外分析剪切力作用下替格瑞洛的抗血小板疗效。方法采用微流控芯片技术检测300/s、1500/s剪切率条件下替格瑞洛对血小板聚集行为的影响,以血小板聚集体表面覆盖率为量化指标,计算替格瑞洛半抑制率;运用光学比浊法验证替格瑞洛抑制ADP诱导的血小板聚集效应;应用微流控芯片构建体外狭窄血管模型,探究高剪切率作用下血小板反应性,并采用流式细胞术分析替格瑞洛对高剪切诱导活化的血小板膜表面纤维蛋白原受体(PAC-1)和P-选择素(CD62P)表达的影响。结果在300/s、1500/s剪切率流动条件下,替格瑞洛呈浓度依赖性抑制血小板聚集,300/s较1500/s抑制程度更明显(P均<0.001),当浓度≥4μmol/L时几乎完全抑制血小板聚集;替格瑞洛抑制ADP诱导的血小板聚集效应与流动条件下的结果相似,亦呈浓度依赖性抑制血小板聚集;替格瑞洛能够抑制PAC-1和CD62P的表达。结论应用微流控芯片技术分析血小板聚集和流式细胞术检测血小板活化,与仅用ADP诱导的基于聚集的分析相比,可确定不同患者对替格瑞洛反应的差异性。

不同药物对人肺巨细胞癌PGCL3细胞表面表达的血小板免疫相关抗原的影响

利用铺有 Ｍａｔｒｉｇｅｌ的 Ｂｏｙｄｅｎ小室观察抗ＣＤ９、抗ＣＤ４２ａ、抗ＣＤ ６３、抗ＴＳＰ抗体对ＰＧ－ＣＬ３细胞侵袭作用的影响；采用流式细胞术观察２．５、１０、２０ｍｇ／Ｌ的川芎嗪、丹参酮ⅡＡ和５０、５００、１０００ Ｕ／Ｉ。的水蛙素和凝血酶对 ＰＧＣＬ３细胞膜表面 ＣＤ９、ＣＤ４２ａ、ＣＤ６３、ＴＳＰ表达的影响，观察川芎嗪、丹参酮ⅡＡ、水蛭素和凝血酶对人肺巨细胞癌ＰＧＣＬ３细胞表面血小板免疫相关抗原ＣＤ９、ＣＤ４２ａ、ＣＤ６３和ＴＳＰ表达的影响，部分阐述各种药物对肿瘤粘附和侵袭影响的不同作用机制。结果抗ＣＤ９抗体明显增加 ＰＧＣＬ３细胞的侵袭，而抗ＣＤ４２ａ、抗ＣＤ６３、抗ＴＳＰ抗体不同程度减少ＰＧＣＬ３细胞的侵袭。川芎嗪可使ＣＤ９＋、ＣＤ４２ａ＋、ＴＳＰ＋细胞的数目减少，ＰＧＣＬ３细胞表面ＣＤ９的表达减少；丹参酮ⅡＡ使ＣＤ９的表达有所增加，ＣＤ６３和 ＣＤ４２ａ的表达有所下降，ＣＤ４２ａ＋、ＴＳＰ＋的细胞数目下降；水蛭素使ＣＤ９、ＣＤ６３和ＣＤ４２ａ的表达有所减弱，ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ６３＋细胞的比例下降；凝血酶使ＣＤ９和ＣＤ４２ａ的表达有所减弱，并使ＣＤ４２ａ＋的细胞数目减少。提示川芎嗪、丹参酮ⅡＡ、水蛭?

冠心病患者抗血小板治疗短期内血小板多项参数的变化趋势

目的:观察不同类型冠心病患者血小板活化、血小板聚集率,比较各组间差异及同组患者治疗前后血小板各项指标的变化。方法收集我院心内科2011年3月至2012年2月期间108例冠心病患者:分为稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、急性心肌梗死3组。入院时均查血小板活化指标PAC-1、CD62p和血小板聚集率(分别由AA或ADP诱导的),比较各组间上述指标的差异。按病情给予抗血小板治疗、PCI治疗及其他常规治疗,治疗10d后重复检查上述指标,比较治疗前后上述各项指标变化及治疗后各组患者与正常对照组间的差异程度。结果:入院时冠心病各组的PAC-1、CD62p阳性率、血小板聚集率水平均较对照组高(P<0.05),而AMI组最为显著。治疗10d后各组CHD患者上述指标均较入院时明显降低(P<0.01)。治疗后,除SAP组患者CD62p对比对照组无明显差异,其余各组CD62p及各组PAC-1仍高于对照组(P<0.05)。结论:PAC-1、CD62p、血小板聚集率可作为早期发现冠心病、观察病情变化、实现个体化治疗的重要方法。

流式细胞术与光学比浊法检测血小板聚集率的比较

目的比较流式细胞术(FCM)和光学比浊法(LTA)检测血小板聚集率的相关性和一致性。方法选取35例健康志愿者和66例冠心病(CHD)患者,分别用FCM和LTA检测血小板聚集率,经Pearson相关性分析及Bland-Altman分析,评价FCM检测血小板聚集率与LTA检测结果的一致性。结果健康人组LTA和FCM检测血小板聚集率结果分别为(57.74±15.39)%、(60.74±15.15)%,差异未见统计学意义(P>0.05);CHD组LTA和FCM检测血小板聚集率结果分别为(63.46±20.75)%、(66.47±23.23)%,差异未见统计学意义(P>0.05);健康人组、CHD组及所有研究对象LTA和FCM血小板聚集率结果经Pearson相关分析,结果呈正相关性(r值分别为0.871、0.812、0.827,P均<0.01);健康人组、CHD组、所有研究对象经Bland-Altman评价提示该两种检测方法具有较好的一致性。结论 FCM检测血小板聚集率与LTA具有较好的一致性和相关性。

基于流式细胞术的小鼠血小板聚集率检测方法评价及川芎嗪的干预作用

目的评价一种新的基于流式细胞术(Flow cytometry,FCM)小鼠血小板聚集活性检测方法,以及川芎嗪的干预作用。方法 CD61-PE和CD61-FITC标记的小鼠血小板(n=5)混合后加入ADP(终浓度20μmol/L)诱导血小板聚集,同时标记两种荧光染料的细胞群占所有血小板的百分比来评估血小板聚集功能;16只雄性C57BL/6J小鼠随机分为生理盐水组和氯吡格雷组,FCM检测小鼠血小板聚集功能;FCM检测川芎嗪(TMPZ)低、中、高浓度(终浓度分别为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL)和替罗非班(终浓度为5μg/mL)对小鼠血小板聚集功能的影响。结果经ADP(终浓度20μmol/L)诱导激活后含有双色荧光标记的细胞群即血小板聚集体明显增多(P<0.01);FCM检测小鼠服用氯吡格雷后其血小板聚集率显著降低[由(19.57±1.12)%降至(8.71±1.21)%,P<0.01];与生理盐水组相比,TMPZ低、中、高剂量和替罗非班均能显著降低小鼠血小板聚集率(P<0.05)。结论基于流式细胞术的小鼠血小板聚集活性检测方法能够准确反映P2Y12受体拮抗剂、GPⅡb/Ⅲa受体阻断剂以及川芎嗪的抗血小板活性,对于血小板相关基础研究和抗血小板药物筛选平台具有借鉴价值。

慢性肾功能衰竭患者血小板膜糖蛋白Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合物表达的研究

目的:观察慢性肾功能衰竭(CRF)患者血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合物及其组分GPⅠbα的表达与正常人之间的差异。方法:采用流式细胞术检测CRF患者血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物和GPⅠbα的表达,采用比浊法检测其血小板最大聚集率(MA)。结果:CRF患者GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物、GPⅠbα表达和MA明显低于正常对照组(P=0.013,P=0.001,P=0.006);相关性分析显示GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物和GPⅠbα的表达与血肌酐呈明显负相关(P=0.041,P=0.026)。结论:血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物作为凝血酶和血管性血友病因子的受体,在CRF患者体内的表达下降,导致血小板聚集功能障碍,可能是CRF出血倾向的重要原因之一。

不同抗凝剂对血小板聚集和血小板膜糖蛋白的影响

目的探讨枸橼酸钠、肝素、乙二胺四乙酸(EDTA)对流式细胞术测血小板膜糖蛋白PAC-1和CD62P与二磷酸腺苷(ADP)和花生四烯酸(AA)血小板诱导聚集的影响。方法在不同抗凝剂情况下,采用血浆比浊法和流式细胞术观测70例健康志愿者血小板AA和ADP诱导聚集率和两个糖蛋白活化百分率。结果枸橼酸钠抗凝标本AA诱导血小板聚集率与肝素抗凝相当,ADP诱导聚集比肝素抗凝低(P<0.05),EDTA抗凝标本血小板几乎不聚;CTAD管抗凝标本所测的两个糖蛋白活化百分率最低,枸橼酸钠抗凝高,肝素抗凝活化百分率最高;EDTA抗凝CD62P活化百分率高(仅次于肝素),PAC-1值很低,即EDTA对PAC-1表达是抑制的。结论枸橼酸钠为血小板聚集最佳抗凝剂;CTAD抗凝能最大限度防止血小板体外活化,是流式细胞术测血小板膜糖蛋白的抗凝最佳方案。

脑梗死患者血小板活化状态及血小板参数的研究

目的:探讨脑梗死患者血小板膜糖蛋白P选择素(CD62P)、溶酶体蛋白(CD63)以及血小板3项参数即血小板计数(PLT)、血小板平均体积(MPV)和血小板最大聚集率(MAR)的变化及意义。方法:采用流式细胞术测定168例脑梗死患者血小板活化指标CD62P、CD63的表达,同时对其进行血小板3项参数PLT、MPV和MAR的测定,并与对照组比较。结果:(1)脑梗死患者急性期CD62P、CD63、MPV及MAR较健康对照组以及恢复期患者显著升高,而且恢复期患者上述指标仍高于健康对照组(均为P<0.01),而PLT在脑梗死急性期、恢复期及健康对照组之间均无显著性差异(均为P>0.05)。(2)CD62P、CD63、MPV及MAR与神经功能缺损程度评分呈显著直线正相关(r=0.84、0.817、0.684和0.698,均为P<0.01),而PLT与神经功能缺损程度评分间无相关性(r=0.32,P>0.05)。结论:脑梗死患者血小板大量活化及其体积和最大聚集率的升高参与了脑梗死的病理过程,MPV和MAR较PLT更能反映脑梗死的严重程度。

药物洗脱支架对老年急性冠状动脉综合征患者内皮祖细胞的影响

目的探讨急性冠状动脉综合征患者行药物洗脱支架置入后,对内皮祖细胞(EPC)数量及功能的影响。方法选择急性冠状动脉综合征患者60例,根据治疗分为支架置入组32例和单纯药物组28例,均在入院时、术后1周及6个月采用流式细胞仪测定外周血中CD34/KDR单个核细胞水平;外周血分离单个核细胞体外诱导培养2周,异硫氰酸荧光素标记荆豆凝集素Ⅰ和DiI标记乙酰化低密度脂蛋白免疫荧光染色双阳性细胞为正在分化的EPC,分别观察其集落形成、增殖及迁移能力。结果与术前比较,支架置入组术后1周及6个月EPC数量、双阳性细胞数量、迁移及增殖能力明显增高(P<0.05);与单纯药物组比较,支架置入组术后1周及6个月EPC数量、双阳性细胞数量、迁移及增殖能力明显增高(P<0.05)。结论药物洗脱支架置入后EPC数量及功能均增加,从而有助于改善动脉血管内皮功能。

血小板功能检测及其应用的研究进展

血小板在正常止血过程中十分重要 ,当血小板数量或功能发生变化时 ,机体易于发生出血或血栓。目前 ,检测血小板功能的方法日益增加 ,包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力等。近年来随着对血小板激活机制的深入研究以及生物化学、免疫和分子生物学技术的不断发展 。

流式细胞术观测松龄血脉康对糖尿病患者血小板活化状态的影响

目的观察松龄血脉康对糖尿病患者血小板活化状态的影响。方法选取140例血糖控制平稳的糖尿病患者,将其随机分为阿司匹林组(50例)、松龄血脉康组(50例)及对照组(40例);另选取25例健康者作为正常对照组。糖尿病患者在原有血糖控制治疗的基础上,阿司匹林组和松龄血脉康组分别给予阿司匹林或松龄血脉康治疗,对照组不加用药物。利用流式细胞仪测定糖尿病患者及健康者用药前及用药1周、4周后血小板活化的标志物——血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa纤维蛋白原受体(PAC-1)的活性,并与正常对照组比较。结果用药前糖尿病患者血糖控制平稳后PAC-1活性仍较正常对照组显著升高,经阿司匹林或松龄血脉康治疗1周、4周时PAC-1活性较用药前显著降低,较对照组治疗后的PAC-1活性亦显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论即使糖尿病患者血糖控制平稳,其血小板活化率仍然高于健康者;松龄血脉康治疗可以降低糖尿病患者的血小板活化程度,其作用与阿司匹林相当。

PL-11多参数血小板功能分析仪与流式细胞术检测血小板聚集功能的效果比较

目的:评价PL-11多参数血小板功能分析仪检测血小板聚集功能的价值。方法:使用PL-11多参数血小板功能分析仪与流式细胞术,检测95例服用氯吡格雷抗凝治疗的、脑梗死二级预防患者的血小板聚集功能,以流式细胞术中测定血小板血管扩张剂刺激磷蛋白(VASP,Vasodilator-stimulated phospho-protein)磷酸化而计算出来的血小板反应指数(PRI,Platelet Response Index)≥50%为氯吡格雷低反应性的标准,分析两种方法的相关性及差异。结果:经血小板聚集诱导剂二磷酸腺苷(ADP,Adenosine Diphosphate)诱导的PL-11最大血小板聚集率(MAR,Max Aggregation Ratio)与血小板反应指数(PRI)的相关性分析(r=0.898,P<0.001),说明两种检测方法存在明显相关。其中,PL-11测得最大血小板聚集率范围均较血小板反应指数广。结论:PL-11多参数血小板功能分析仪与流式细胞术检测血小板聚集功能的结果差异无统计学意义(P>0.05),具有一致性,其应用价值可供临床及实验室参考,可以用于氯吡格雷反应性的评价。

应用流式细胞术研究剪切力诱导的血小板聚集

目的 建立流式细胞术方法检测剪切力诱导的血小板聚集 (SIPA) ,研究不同剪切力作用后血小板聚集率的变化规律 ,并初步探讨SIPA测定的临床意义。方法 用锥板黏度计对全血标本施加剪切力作用 ,使血小板产生聚集反应 ,再以荧光抗体CD6 1PerCP标记血小板 ,然后进行流式细胞术分析 ,测定血小板聚集率的大小 ;同时在显微镜下直接观察血小板聚集体形态。结果 不同的剪切力作用后 ,血小板产生聚集反应程度不同。在 10 0S-1剪切作用下 ,只有少量的血小板聚集 ;5 0 0S-1时 ,血小板聚集增加 ;在高于 2 0 0 0S-1的剪切作用下 ,30s即可发生明显的血小板聚集 ,30 0 0S-1剪切作用 3min时血小板聚集率为 (5 8 4± 5 3) % ,已接近最大值 ,明显高于 10 0S-1的(9 4± 1 3) %和 5 0 0S-1的 (2 6 4±3 2 ) %。随着剪切力的增大和作用时间的延长 ,血小板聚集体逐渐增大 ,结构由松散到致密。AMI、脑梗死、TIA、糖尿病等动脉血栓相关性疾病患者的高剪切力诱导的血小板聚集明显高于正常。结论 直接的剪切力作用能够诱导血小板发生聚集反应 ,聚集程度与剪切力的大小和作用时间成正相关 ;

流式细胞术检测特发性血小板减少性紫癜患者血小板微粒

目的建立CD61与Annexin V双染法检测外周血中循环血小板微粒的方法,探讨血小板微粒在特发性血小板减少性紫癜患者中的临床意义。方法使用流式细胞术检测了12例特发性血小板减少性紫癜患者和15例健康对照者外周血中血小板微粒的含量。采用CD61与Annexin V双染法,CD61弱阳性并且Annexin V强阳性者定义为血小板微粒,分析血小板微粒的百分含量。结果CD61与Annexin V双染法能够清楚地区分出富血小板血浆中血小板微粒。特发性血小板减少性紫癜患者血小板微粒为12.3%±5.4%,健康对照组为1.1%±0.3%,P<0.05,差异显著。结论CD61与Annexin V双染法能够准确检出外周血中循环的血小板微粒。血小板微粒检测在特发性血小板减少性紫癜患者中有一定的临床意义。

大容量人血小板冻干保存的初步研究

目的为使血小板冷冻干燥保存技术用于军队临床战创伤救治,在小容量冻干保存的基础上研究大容量人血小板的冷冻干燥技术。方法采用特制血盒作为冻干容器,以20%(w/v)海藻糖和1%(w/v)牛血清白蛋白作为冻干保护剂。冻干样品复水后测量血小板的数值恢复率和体积分布参数,应用流式细胞仪检测血小板的凋亡率和活化率,采用二磷酸腺苷和肾上腺素检测血小板的聚集功能。结果大容量血小板冻干复水后的数值恢复率为(66.3±2.1)%,平均血小板体积较新鲜血小板有明显增加,冻干血小板的细胞凋亡率达20%左右;冻干和复水过程还造成小部分血小板被激活,其最大聚集率为新鲜血小板的50%左右。结论大容量血小板冻干复水后的恢复率较低,形态结构、活性和功能指标均低于新鲜血小板,但基本可以满足血小板临床止血功能标准。

血小板无力症患者血小板GPⅡbⅢa受体亲和力的改变及临床意义(英文)

目的 探讨血小板无力症 (Glanzmann’sThrombasthenia ,GT)患者血小板聚集功能异常的可能机制。方法 采用Western印迹分别检测正常人、GT患者及其父母血小板CPⅡbⅢa的含量 ,流式细胞术分析血小板膜CPⅢa的表达和血小板结合活化型单抗PAC - 1的能力。结果 与正常人相比 ,GT患者GPⅡbⅢa明显减少 ,其血小板结合PAC - 1的能力亦明显低下。结论 GPⅡbⅢa激活受阻可能为部分GT患者血小板聚集功能障碍的分子基础。

不同处理方法对流式细胞术检测外周血单核细胞-血小板聚集体的影响

目的：探讨实际工作中不同处理方法对流式细胞术检测单核细胞-血小板聚集体（ MPA）的影响，为准确检测MPA提供依据。方法获取枸橼酸钠抗凝外周静脉全血，分别以CD14-藻红蛋白（ PE）、CD61-异硫氰酸荧光素（ FITC）标记单核细胞、血小板，以CD62P-PE标记活化血小板，使用流式细胞术检测CD14-PE／CD61-FITC双阳性MPA占单核细胞百分比及血小板CD62P阳性率。采用不同处理方法[全血标本处理前后放置不同时间、全血固定后立即标记抗体或放置不同时间后标记抗体、抗体标记前全血离心处理、不同抗体组合（抗CD14-PE和抗CD61-FITC ，抗CD14-PE和抗CD41-ECD，抗CD45-ECD和抗CD61-FITC）]检测MPA，比较各种处理方法检测的MPA是否有差异。结果与获取标本后立即处理比较，放置于室温（18～25℃）和低温（2～8℃）， MPA百分比、血小板CD62P阳性率均随放置时间的延长而增加（P＜0．05），两者呈正相关（室温r＝0．82，P＜0．05；低温r＝0．83，P＜0．05）。标本处理后立即检测或低温保存放置至24 h再检测， MPA百分率差异无统计学意义（P＞0．05）。与固定前标记抗体的处理方法比较，1％多聚甲醛低温固定全血标本后标记抗体，或者低温保存放置至24 h再标记抗体，MPA百分率差异无统计学意义（P＞0．05）。全血标本离心处理后，MPA百分率和血小板CD62P阳性率均明显增加（P＜0．05）。不同的抗体组合检测MPA百分比的差异均无统计学意义（P均＞0．05）。结论获取全血标本后应尽快处理，不能立即处理的应使用固定剂固定后可低温保存24 h。在标记新鲜全血标本前，应避免离心，处理完毕的标本使用固定剂固定后可低温保存24 h再用流式细胞术检测。不同抗体组合应验证后使用，CD14／CD61、CD14／CD41、CD45／CD61组合均适用于检测MPA。

应用流式细胞术检测血小板聚集及活化功能临床观察

目的:探讨应用流式细胞术全血法检测血小板功能、影响因素及临床意义。方法:应用血小板特异性荧光抗体CD61-FITC标记血小板,并以0.82μm标准微球进行定位对照和设置机器检测条件,调节机器阈值,设门计数血小板微颗粒(PMP)占CD61阳性颗粒的百分比。以ADP及胶原诱导血小板活化,计数活化以后血小板释放的PMP,以未加血小板激活剂的标本作为零聚集对照,激活剂活化的标本以单个血小板数量的减少反应血小板聚集率的多少,并进行方法学的评价。结果:该方法能够有效的检测PMP及低浓度诱导剂诱导下的血小板聚集,检测的血小板聚集功能敏感度明显高于比浊法。应用枸橼酸钠和CTAD抗凝样本,检测结果显示CTAD抗凝的全血静息状态下血小板释放PMP的量显著低于枸橼酸钠抗凝全血释放PMP量。结论:流式细胞术全血法检测血小板功能方法准确、敏感,快速、简便适合于临床常规检测。

阿司匹林与血小板膜糖蛋白CD42b、CD41a的相关性研究

目的探讨服用阿司匹林前后,心脑血管疾病患者外周血血小板表面CD42b、CD41a表达的变化,研究阿司匹林对血小板聚集功能及血小板表面糖蛋白表达量的影响。方法用流式细胞仪测定31例心脑血管疾病患者在服用阿司匹林前及用药1周后外周血血小板膜CD42b、CD41a的表达,血小板聚集仪测定血小板聚集功能。结果与服用阿司匹林前相比,用药1周后,ADP和AA诱导的血小板聚集率显著降低,而CD42b和CD41a的表达量改变并不十分显著。结论长期服用小剂量(100mg)阿司匹林能够有效抑制血小板的聚集,但不能抑制血小板表面CD42b、CD41a的表达量。

2型糖尿病患者检查血小板-白细胞聚集体的临床意义

目的研究2型糖尿病(T2DM)患者外周血血小板-白细胞聚集体(PLA)与血小板活化标志CD62p的变化,分析诊断微血管病变的敏感性与特异性,为T2DM患者的诊断、治疗及并发症防治提供实验依据。方法用流式细胞术(FCM)检测T2DM患者外周血血小板CD62p、血小板-粒细胞聚集体(PNA)、血小板-淋巴细胞聚集体(PLyA)和血小板-单核细胞聚集体(PMA)的表达百分率。结果 T2DM组CD62p、PNA、PLyA及PMA的表达率(%)分别为13.38±8.56、16.44±7.71、13.57±7.30、20.07±9.17,均显著高于健康对照组(P均<0.05);T2DM组中有微血管病变组明显高于无微血管病变组(P均<0.05);其中CD62p的敏感性为93.5%,特异性为90.9%;PNA为60.9%和54.5%;P lyA为65.2%和54.5%;PMA为78.3%和68.2%。结论 PNA、PLA、PMA、CD62p均可作为反映T2DM患者微血管病变的临床指标,其中CD62p和PMA较为灵敏和特异,CD62p是首选指标。