蝮蛇毒血小板抑制因子对动脉血栓形成的影响及机制研究

目的:探讨皖南蝮蛇毒血小板抑制因子(AHV-PI)对家兔动脉血栓形成的影响及可能机制。方法:新西兰家兔24只,随机分成假手术组、动脉血栓模型组、阳性对照组(奥扎格雷钠,5mg/kg),AHV-PI(0.1mg/kg)实验组共4组,每组6只。应用70%FeCl3溶液化学损伤的方法来制备家兔颈动脉血栓模型,采用血栓弹力仪(TEG)描计血栓弹力图,比浊法测定家兔血小板聚集率,ELISA测定各组血浆中α颗粒膜蛋白(GMP-140)和血栓素B2(TXB2)水平,光镜和透射电镜分别观察动脉血栓形成和血小板形态的改变。结果:AHV-PI实验组与模型组相比,血栓弹力图凝血时间(R)值和血凝块形成时间(K)值延长(P<0.01和P<0.05),Alpha角度、最大幅度(MA)和凝血指数(CI)减小(P<0.05和P<0.01);血小板聚集率的各项指标均明显降低(P<0.05);血浆中GMP-140和TXB2含量降低(P<0.01)。AHV-PI实验组光镜下动脉内未见血栓形成,血小板电镜显示血小板形态基本规则,与模型组相比伪足较少,α-颗粒和致密颗粒无明显减少,胞浆空泡化现象减轻。结论:AHV-PI可以通过抑制血小板聚集,防止动脉血栓的形成,其机制可能与之保护血小板超微结构,减少血小板脂质代谢和颗粒内容物的释放有关。

尖吻蝮蛇毒小分子多肽的分离及抗血小板聚集作用

目的从尖吻蝮蛇毒中分离纯化一种抗血小板聚集小分子多肽,研究其理化性质以及对ADP、胶原、凝血酶诱导的血小板聚集反应的影响。方法经SephadexG-75凝胶过滤,超滤,DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析法分离纯化蛇毒组分,采用高效液相鉴定纯度,用SDS-凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子量,用比浊法测定其抗血小板聚集活性。结果从尖吻蝮蛇毒中分离相对分子质量约为7862u等电点为4.29的组分,该组分能抑制由ADP、胶原、凝血酶诱导的血小板聚集并成剂量依赖性。结论此法成功地从尖吻蝮蛇毒中纯化出抗血小板聚集组分。该组分与去整合素比较相似,可能属于去整合素家族。

尖吻蝮蛇毒活性肽K组分的研究

目的从尖吻蝮蛇毒中分离纯化一种小分子活性肽K组分,测定其理化性质及生物学活性。方法经Sephadex G-75凝胶过滤,超滤,DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析法分离纯化活性肽K,采用高效液相鉴定纯度,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子量,等电聚焦法测定等电点,用比浊法测定其抗血小板聚集活性,通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验检测K组分对血管生成的影响。结果从尖吻蝮蛇毒中分离相对分子量约为7 862D,等电点为4.29的组分。该组分能抑制由二磷酸腺苷(ADP)、胶原(collagen)、凝血酶(thrombin)诱导的血小板聚集并成剂量依赖性;具有抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用。结论从尖吻蝮蛇毒中纯化出活性肽K,该组分有很强的抗血小板聚集和抗血管生成作用。

中国蝮蛇蛇毒中小肽SV-PP-3的分离及其抗血小板聚集作用

目的研究中国蝮蛇蛇毒中具有抑制血小板聚集作用的小肽。方法采用低温离心、SephadexG-75凝胶层析、高效液相C-18反相层析从蛇毒中分离纯化小肽,并用血小板聚集仪测定分离的小肽在体外对磷酸腺苷(ADP)诱导的兔血小板聚集作用。结果SV-PP-3是从中国蝮蛇蛇毒中分离出一种相对分子质量为1234.557的新的小肽。SV-PP-3在体外能显著抑制ADP诱导的兔血小板聚集,具有剂量依赖性。结论SV-PP-3对ADP诱导的兔血小板聚集具有显著的抑制作用。

蝮蛇毒血小板抑制因子减轻LPS诱导的内皮细胞损伤

目的:探讨蝮蛇毒血小板抑制因子(AHV-PI)对体外脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)损伤的影响及其作用机制。方法:体外培养HUVECs,运用LPS(1 mg/L)诱导HUVECs炎症损伤模型,实验分为空白对照组、LPS组、AHV-PI组和AHV-PI+LPS组。MTT比色法检测HUVECs的活力,倒置显微镜观察HUVECs的形态变化,筛选出AHV-PI最适浓度为5 mg/L。流式细胞术检测细胞凋亡;免疫组化法观察胞内组织型纤溶酶原激活物(T-PA)以及纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达情况;ELISA法检测HUVECs上清液中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和组织因子(TF)含量;免疫荧光染色检测胞核内NF-κB亚基p65激活转位情况。结果:LPS组细胞明显梭形化,长宽比增大,呈成纤维细胞状,胞浆出现颗粒样物质。AHV-PI浓度低于5 mg/L时对HUVECs的活性和形态没有明显影响,但可减轻LPS引起的HUVECs的活力抑制和形态改变。与对照组比较,LPS组上清液中TF和ICAM-1含量升高,胞内T-PA和PAI-1表达减少;与LPS组相比,AHV-PI+LPS组上清液中TF和ICAM-1的含量显著降低,细胞内T-PA和PAI-1表达增多,细胞核内NF-κB p65表达减少。结论:AHV-PI能减轻HUVECs损伤,其保护机制与抑制细胞因子分泌及NF-κB活化有关。

蛇毒血小板抑制因子对心肌缺血再灌注损伤大鼠血小板膜糖蛋白Ⅵ表达以及血液流变的影响及意义

目的:探讨皖南蝮蛇毒血小板抑制因子(agkistrodon halys venom platelet inhibitor,AHV-PI)对心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)、大鼠血小板膜糖蛋白VI(GPVI)表达以及血液流变的影响及意义。方法:SD雄性大鼠30只,随机分为假手术组(6只)、心肌缺血再灌注损伤模型组(6只)和AHV-PI实验组(18只),实验采用结扎大鼠左冠状动脉前降支方法制备大鼠MIRI模型。AHV-PI实验组根据大鼠舌下静脉注射AHV-PI的剂量(0.05,0.1,0.2 mg/kg)再依次分为低、中、高三组,每组6只,RM6240生物信号采集处理系统监测心电变化。蛋白质免疫印迹法(Western blot)监测AHV-PI干预下,大鼠GPVI的表达水平。血栓弹力仪(TEG■5000)描记凝血时间(R)、血凝块形成时间(K)、Alpha角度(A)和凝血最大幅度(MA)。采用比浊法检测血小板聚集率。结果:与MIRI模型组相比,AHV-PI中剂量实验组和高剂量实验组GPVI表达水平明显降低(P<0.05);R值和K值明显延长,A值和MA值减小(P<0.05);血小板聚集时间、聚集幅度和聚集率均明显降低(P<0.05)。结论:AHV-PI可显著抑制MIRI大鼠GPVI的表达并可改善大鼠心肌损伤相关的血液流变学特性,进而弱化其损伤过程。

AHV-PI抗血小板聚集的PI3K/Akt信号通路机制研究

目的 探讨蝮蛇毒血小板抑制因子（AHV-PI）抗血小板聚集的细胞内信号转导通路及其可能机制。方法 通过蛋白质免疫印迹（Western blot）检测AHV-PI对血小板内Akt蛋白激酶磷酸化水平情况,XS-1000I五分类血球计数仪进行血小板计数;酶联免疫吸附法（ELISA）测定家兔血浆中5’-核苷酸酶（5’-NT）,血小板膜糖蛋白Ib（GPIb）含量;流式细胞术（FCM）观察AHV-PI对荧光标记的单克隆抗体CD61（FITC-CD61）与血小板膜糖蛋白IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）结合率的影响。结果 AHV-PI能降低Akt磷酸化水平,减少血小板数量,升高血浆中5’-NT含量,降低血小板GPIb的表达;AHV-PI对单克隆抗体CD61与血小板的结合率没有影响。结论 AHV-PI可以通过抑制蛋白激酶Akt磷酸化来阻断Akt通路的信号转导,限制细胞生长,减少血小板数量;具有5’-核苷酸酶的活性,能够降解ADP,防止血小板性血栓的形成。

浙江产蝮蛇蛇毒对血小板聚集的影响

浙江产蝮蛇蛇毒的分离参照涂光俦(1979)的方法。浙江产蝮蛇蛇毒经DEAE-Sephadex A-50柱层析分离后得到14个蛋白峰,各峰的蛋白含量见表1。将收集的各峰经适当稀释后取0.2ml进行酶活力测定,除磷脂A酶活力按吴新陆、陈远聪(1981)方法测定外,其他酶活力测定如前文(云南省动物研究所,1976),然后做各峰对血小板聚集功能的影响,参照阮长耿等(1983)的方法,所用诱导剂的浓度为ADP(2μM),AA(100μg/ml)以及PAF(3×10^(-7)M),用这三种诱导剂诱导键康人对血小板产生不可逆性聚集,聚集强度分别为75%,75%和70%。粗毒在最终浓度为250μg/ml时能完全抑制上述三种诱导剂所致的血小板聚集。

江浙蝮蛇毒抗血小板聚集组分的分离纯化及活性分析

蛇毒 ,特别是蝰蛇和眼镜蛇家族蛇毒含有相当数量作用于血小板的活性成分 ,它们可诱导或抑制血小板聚集。一些相关成分应用于临床有望作为有效药物治疗出血或血栓性疾病。江浙蝮蛇属蝰蛇类 ,是我国特有的蛇种。本研究以是否抑制ADP诱导的血小板聚集作为示踪 ,从江浙蝮蛇毒中分离纯化出一种血小板聚集抑制剂并对其生化特性做进一步探讨。江浙蝮蛇毒经DEAE SepharoseCL 6B ,SephadexG 75及在FPLC上利用SP Sepharose和MonoQ层析 ,得到SDS PAGE条带均一、分子量为 6 5kD的蛋白质组分。该物质无磷脂酶A2、精氨酸酯酶及纤溶酶活性 ,具有拮抗ADP、胶原诱导的血小板聚集作用。结论 :分子量为 6 5kD的蛋白质组分 ,可抑制ADP、胶原诱导的血小板聚集 ,且呈明显的剂量

蝮蛇毒抗凝血活酶组份及几种蛇毒粗毒对人红细胞和血小板的作用

蝮蛇毒抗凝血活酶组分及蝗蛇毒、圆斑蝰蛇毒和眼镜蛇毒粗毒,不仅能够水解血浆中的磷脂,而且还能水解完整人红细胞膜和完整人血小板膜上的磷脂。但是五步蛇毒和金环蛇毒粗毒却不能水解完整人血小板膜上的磷脂。扫描电镜观察表明,由于抗凝血活酶组份和几种蛇毒粗毒的作用,人红细胞和人血小板的形态发生了巨大的变化;人红细胞由正常的双圆盘形变成带刺的小球,人血小板的外形变成蜂窝状。