产单核细胞李斯特菌actA/plcB缺失株的构建及其生物学特性

产单核细胞李斯特菌的毒力因子与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系,其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子,而广谱磷脂酶C则参与具有双层膜吞噬体的裂解过程。[方法]本研究中利用同源重组技术成功构建了毒力因子ActA和PC-PLC双缺失的突变株,[目的]并对突变株的毒力和免疫应答潜能进行评价。[结果]Western blot和磷脂酶活性测定实验,分别从蛋白质水平上证实actA和plcB基因的缺失。突变株的毒力显著降低,对小鼠半数致死剂量比野生型菌株提高约103倍,但仍然保持较好地诱导T细胞应答的能力,并且能完全保护野生型细菌致死剂量的攻击。实验结果不仅表明ActA和PC-PLC是产单核细胞李斯特菌的重要毒力因子,而且证实安全性提高的突变株依然保持有较强地诱导细胞免疫应答的能力。[结论]因此,该突变株的获得不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用,而且为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础,此外对于阐明LM毒力因子的致病机理与免疫保护作用提供了条件。

产单核细胞李斯特菌plcB基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达产单核细胞李斯特菌plcB基因。方法利用PCR技术从产单核细胞李斯特菌基因组中扩增不含编码信号肽的plcB基因。采用T-A克隆构建pGEM-T-plcB重组质粒,BamHI、XhoI双酶切pGEM-T-plcB获得plcB片段后再插入pGEX-6p-1原核表达载体,获得pGEX-6p-1-plcB重组表达质粒并在表达宿主菌BL21中诱导表达。对表达产物进行纯化和SDS-PAGE、Western-blotting、磷脂酶活性实验分析。结果克隆的plcB基因长834bp,与GenBank上公布的序列完全相同;表达的与GST标签蛋白融合的广谱磷脂酶C蛋白(GST-PC-PLC)具有磷脂酶生物活性和免疫原性。结论成功构建产单核细胞李斯特菌plcB基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中得到有效表达,这为进一步研究PC-PLC蛋白的致病与免疫机理奠定了基础。

PLCB4/PLCB1基因多态性与川崎病患儿冠状动脉损伤的相关性

目的探讨PLCB4/PLCB1基因的SNP位点(rs6140791)多态性与川崎病(KD)患儿冠状动脉损伤(CAL)及其他临床特点的关系。方法选取322例典型KD患儿为研究对象,根据有无CAL把患儿分为CAL组和非CAL组。利用PCR-RFLP方法测定SNP位点多态性分布,并收集患儿免疫学指标。结果 CAL组患儿血清Ig M水平高于非CAL组(P=0.041),CD16/CD56细胞的绝对值低于非CAL组(P=0.036)。CAL组患儿SNP位点(rs6140791)的基因型(CC、CG、GG)频率分布与非CAL组患儿相比差异有统计学意义(P=0.032),且等位基因频率差异亦有统计学意义(P=0.007),C等位基因为风险因子。比较不同的基因型之间的免疫球蛋白水平及淋巴细胞亚群绝对值之间的差异,发现各基因型之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 PLCB4/PLCB1基因的SNP位点(rs6140791)多态性与KD患儿冠状动脉损伤的易感性相关,C等位基因为风险因子;该位点的多态性与患儿的免疫学指标不相关。

绵羊SPP1和PLCB3基因多态性与产羔数的关联分析

试验旨在探究SPP1基因g.36651870T>C位点多态性、PLCB3基因g.41871219T>C位点多态性与绵羊产羔数之间的关系,以期寻找绵羊产羔数性状相关的分子标记。利用全基因组重测序结合Sequenom MassARRAY誖SNP技术对多羔羊(小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊)和单羔羊(滩羊、苏尼特羊、萨福克羊和草原型藏羊)7个绵羊品种SPP1、PLCB3基因的2个位点进行多态性检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明:2个位点均存在TT、TC和CC三种基因型。SPP1基因g.36651870T>C位点的基因型频率和等位基因频率在两类绵羊品种间差异极显著(P<0.01);PLCB3基因g.41871219T>C位点基因型频率在两类绵羊品种间差异不显著(P>0.05),等位基因频率差异显著(P<0.05)。群体遗传学分析表明,SPP1基因g.36651870T>C位点在小尾寒羊、苏尼特羊、萨福克羊和湖羊中均表现为中度多态(0.25≤PIC<0.5),在滩羊、策勒黑羊和草原型藏羊中表现为低度多态(PIC<0.25);PLCB3基因g.41871219T>C位点在滩羊中表现为中度多态(0.25≤PIC<0.5),在其余6个绵羊品种中均表现为低度多态(PIC<0.25)。卡方适合性检验表明,SPP1基因g.36651870T>C位点在7个绵羊品种中均处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05);PLCB3基因g.41871219T>C位点在小尾寒羊、滩羊、苏尼特羊、策勒黑羊、草原型藏羊5个品种中处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05)。关联分析表明,PLCB3基因g.41871219T>C位点多态性与小尾寒羊第1胎产羔数有显著关联(P<0.05),TT基因型个体产羔数显著高于CC基因型个体;SPP1基因g.36651870T>C位点多态性与小尾寒羊不同胎次产羔数之间无显著关联(P>0.05)。综上,PLCB3基因g.41871219T>C位点对小尾寒羊产羔数性状选育具有一定的参考意义,SPP1基因g.36651870T>C位点不适用于小尾寒羊产羔数性状选育。

N-乙酰半胱氨酸对努比亚山羊PLCB3和MMP2基因表达的影响

为了探究N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)对山羊繁殖性能相关基因PLCB3与MMP2的影响机制,试验以努比亚山羊为研究对象,将其分为饲喂组(0.07%NAC)和空白组,采用实时荧光定量PCR法检测饲喂组和空白组子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢5个器官中PLCB3和MMP2基因表达量的变化。结果表明:空白组和饲喂组PLCB3和MMP2基因在5个器官中均有表达。组内比较,空白组各器官中PLCB3基因的表达量由高到低的顺序为垂体>子宫>下丘脑>输卵管>卵巢,饲喂组中的顺序为垂体>子宫>下丘脑>卵巢>输卵管;组间比较,空白组垂体中PLCB3基因的表达量显著高于饲喂组(P<0.05);总体来看,空白组各器官中PLCB3基因的表达量高于饲喂组。组内比较,空白组各器官中MMP2基因的表达量由高到低的顺序为垂体>子宫>下丘脑>输卵管>卵巢,饲喂组中的顺序为垂体>子宫>下丘脑>卵巢>输卵管,其中垂体和子宫中的表达量极显著高于输卵管、下丘脑和卵巢(P<0.01);组间比较,饲喂组垂体中MMP2基因的表达量极显著高于空白组(P<0.01),子宫中的表达量显著高于空白组(P<0.05);总体来看,饲喂组各器官中MMP2基因的表达量高于空白组。说明在饲粮中添加0.07%的NAC会使PLCB3基因在性腺器官中的表达量降低,MMP2基因在性腺器官中的表达量升高,推测NAC会通过影响性腺轴中PLCB3和MMP2基因表达量来影响努比亚山羊的繁殖性能。

PPP3CA·PLCB1和STK3基因在小尾寒羊性腺轴组织中的表达量研究

为揭示候选基因PPP3CA、PLCB1和STK3在绵羊多羔中的作用,以不同产羔数小尾寒羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术检测PPP3CA、PLCB1、STK3基因在小尾寒羊大脑、小脑、下丘脑、垂体、卵巢、子宫和输卵管中的表达情况。结果表明:PPP3CA基因在小尾寒羊卵巢内的相对表达量高于其他组织,其在FecB BB型小尾寒羊下丘脑中的相对表达量显著高于++型(P<0.05),其在FecB BB型小尾寒羊输卵管中的相对表达量极显著高于++型(P<0.01);PLCB1基因在FecB BB型小尾寒羊小脑中的相对表达量最高,FecB BB型小尾寒羊垂体和卵巢组织中的相对表达量显著高于++型(P<0.05);STK3基因在++型小尾寒羊大脑中的相对表达量高于其他组织,其在FecB BB型小尾寒羊卵巢中的相对表达量极显著高于++型(P<0.01)。该研究结果表明PPP3CA、PLCB1、STK3基因可作为潜在候选基因,参与小尾寒羊多羔性状的调控,且具有一定的正向调节作用。

细胞外基质硬化通过PLCB2促进血管平滑肌细胞迁移

目的探讨细胞外基质硬化对血管平滑肌细胞(VSMC)迁移的影响.方法采用病理和生理硬度细胞外基质中培养的人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)的RNA-seq数据,通过生物信息学分析差异表达的基因和富集通路.采用Western blot和qRT-PCR验证病理和生理硬度细胞外基质对HCASMC中磷脂酶C-β2(PLCB2)表达的影响.采用平板划线和小鼠颈动脉内膜损伤模型,验证PLCB2对HCASMC迁移能力的影响.结果差异表达的基因在Gβγ信号通路(P<0.001,FDR=0.17)和PLC-β介导Gβγ信号通路(P<0.001,FDR=0.12)中显著富集,其中PLCB2基因显著上调.PCR[(4.95±0.27),P<0.001]和Western blot[(2.96±0.13),P<0.001].病理性硬化基质培养的HCASMC中PLCB2显著上调.干扰敲低PLCB2能够抑制细胞外基质硬化对HCASMC的促迁移作用.结论病理性细胞外基质硬化通过上调PLCB2促进VSMC迁移.

基于GRIN2A/PLCB1/PRKCG信号通路探讨白芍总苷减轻马钱子水提物神经损伤的作用机制

目的:研究白芍总苷(TGP)对马钱子水提物(SA)所致小鼠神经损伤的作用及机制。方法:将32只雄性KM小鼠随机分为正常组、SA组(19.5 mg·kg^(-1))、TGP组(225 mg·kg^(-1))、SA+TGP组(SA 19.5 mg·kg^(-1)+TGP 225 mg·kg^(-1))。采用旷场实验、平衡木实验观察小鼠行为学变化。尼氏染色观察大脑皮层区尼氏小体的病理变化。通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠脑组织中丙二醛(MDA)、谷氨酸(Glu)和血清中5-羟色胺(5-HT)的含量。运用转录组学测序检测小鼠脑组织的基因表达谱,共同差异表达基因进行基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测相关靶点mRNA表达水平。结果:与正常组比较,SA组小鼠旷场实验中边上路程和平均速度明显增加,平衡木行走时间明显增加;小鼠皮质神经元轴突消失;脑组织中Glu和MDA含量明显升高(P<0.05,P<0.01),血清中5-HT水平也明显升高(P<0.05)。与SA组比较,SA+TGP组小鼠旷场实验中边上路程和平均速度及平衡木行走时间明显降低(P<0.05,P<0.01);皮质神经元轴突清晰可见;血清5-HT、Glu和MDA含量降低(P<0.05,P<0.01)。转录组结果发现TGP可调控N-甲基-D-天氡氨酸离子能谷氨酸受体2A(GRIN2A)/磷脂酰肌醇特异性磷酯酶Cβ1(PLCB1)/蛋白激酶C-γ(PRKCG)信号通路。与正常组比较,SA可显著降低小鼠脑中GRIN2A、PLCB1、PRKCG mRJA表达(P<0.01),而配伍TGP后,GRIN2A和PRKCG mRNA水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:SA可引起小鼠脑内明显的神经毒性,TGP显著减轻SA所诱导的神经损伤,其机制可能与GRIN2A/PLCB1/PRKCG信号通路有关。

单核细胞增多性李斯特菌硫氧还蛋白TrxA调控磷脂酶PlcB研究

细菌中的硫氧还蛋白A（thioredoxin A,TrxA）能够通过对氧化受损的的二硫键进行修饰进而参与蛋白质的正确折叠。磷脂酶PlcB作为单核细胞增多性李斯特菌（Listeria moncoytogenes）关键的毒力因子在细菌逃逸吞噬体过程中起重要作用,但该蛋白是否受李斯特菌TrxA的修饰尚无报道。因此,本试验主要从转录和蛋白表达水平以及蛋白活性水平研究李斯特菌硫氧还蛋白TrxA对磷脂酶PlcB的调控关系。结果显示,单增李斯特菌野生株EGD-e缺失trxA基因后,PlcB的转录及蛋白表达水平显著降低,且利用天然启动子回补trxA后能够使PlcB的表达恢复至野生株水平,而组成型启动子回补效率较低,表明TrxA能够严谨调控李斯特菌毒力因子PlcB的表达。体外溶脂试验发现李斯特菌缺失trxA后导致其溶脂能力显著降低,磷脂酶活性检测发现重组PlcB的活性高度依赖TrxA的存在。本研究首次发现并证实李斯特菌PlcB的转录和表达及其磷脂酶活性维持受TrxA的调控,研究结果为深入解析李斯特菌硫氧还蛋白系统在细菌感染宿主过程中的氧化还原修饰机制奠定了理论基础。

单增李斯特菌plcB缺失株的生物学特性及酵母双杂交诱饵载体构建

为探究单增李斯特菌磷脂酶PlcB在细菌感染过程中的作用及挖掘可能与宿主互作的相关蛋白,本试验利用李斯特菌遗传操作系统构建了plcB缺失回补株及基于PlcB为诱饵的酵母双杂交系统,并通过体外生长曲线、细胞内增殖试验、空斑形成能力等试验研究PlcB介导的生物学功能;通过酵母双杂交诱饵质粒自激活及毒性试验和诱饵蛋白表达检测等方法鉴定可以用于后续互作蛋白筛选的酵母双杂交诱饵质粒。结果显示,缺失plcB基因不影响李斯特菌的体外生长,但缺失株在RAW264.7巨噬细胞内的生存能力相较野生株显著减弱(P<0.01),在L929成纤维细胞中感染形成的空斑较野生株和回补株极显著下降(P<0.001)。将含有pGBKT7-BD-PlcB诱饵质粒的Y2HGold酵母菌株涂布于缺陷培养基中,未发现毒性及自激活现象;通过Western blot能够检测到酵母载体中诱饵蛋白PlcB的稳定表达,说明酵母双杂交系统构建成功,并证实磷脂酶PlcB在李斯特菌宿主内感染和迁移等过程中发挥了重要作用,且基于PlcB的酵母双杂交体系可以为将来深入挖掘PlcB在感染过程中与宿主重要生物学过程及相关分子的互作交流机制奠定了基础。

基于生物信息学分析骨肉瘤转移的关键基因及预后

目的:通过生物信息学分析筛选出骨肉瘤转移的关键基因,探讨骨肉瘤转移潜在的机制和关键标志物。方法:从TARGET数据库中下载骨肉瘤基因表达谱和临床信息数据,采用R软件的“limma”包筛选骨肉瘤转移组和非转移组的差异基因(Difference genes,DEGs),对差异基因运用R软件的“clusterProfiler”包进行基因本体论(Gene Ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,了解DEGs富集的分子功能及通路,采用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用(Protein-Protein inter-action network,PPI)网络,采用Cytoscape软件对DEGs进行相关性分析,找出与骨肉瘤转移进展最相关的核心基因(Hub gene);对Hub基因进行Kaplan-Meier(K-M)生存分析,明确和验证Hub基因与骨肉瘤患者预后之间的关系,筛选出对预后具有意义的关键基因。结果:分析出248个有差异表达的基因,其中上调18个、下调230个差异基因,GO分析发现主要涉及肌肉组织、器官、系统的发育和横纹肌组织发育,KEGG信号通路主要参与肌动蛋白细胞骨架的调节、Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路,通过PPI网络分析筛选得到20个关键基因,生存分析显示PLCB4的高表达与骨肉瘤患者的不良预后显著相关。结论:PLCB4可能参与骨肉瘤转移,并与预后显著相关,可能成为骨肉瘤患者预后和治疗的潜在靶点。

产单核细胞李斯特菌减毒候选菌株分子生物学特性研究

目的为了确定用于减毒的产单核细胞李斯特菌菌株,对初筛入选的血清型为1/2a菌株Lm1、Lm2、Lm3和Lm4的分子生物学特性进行了比较研究。方法利用PCR技术均成功地扩增出4株菌株的hly基因及actA和plcB基因片段。以LD50的测定试验作为菌株毒力指征,对4株菌株的毒力进行了测定。结果4株菌株均为强毒菌株,其中菌株Lm4的毒力最强,用BALB/c小鼠测得的LD50为1.47×104CFU。结论确定以Lm4作为候选菌株。

下颌发育不良及问号耳畸形患者的致病基因突变遗传分析

探讨具有下颌发育不良及问号耳畸形临床表型的患者家系的临床及遗传学特征.分析2个具有下颌发育不良及问号耳畸形患者家系的临床资料,使用全外显子组测序等遗传学检测方法,寻找候选基因并深入分析相关的基因突变.通过全外显子组检测,在两个患者家系中分别发现PLCB4基因纯合错义突变(Chr20:9364985;NM_000933;exon11;c.991T>C;p.Y331H)和EDNRA基因杂合插入造成的移码突变(Chr4:148457092;NM_001957;exon5;c.811_812insT;p.T271fs),这两个突变均未报道过,且与患者的临床表型具有高度相关性.PLCB4和EDNRA均作用于EDN1-EDNRA-DLX信号通路,该通路已报道对人类咽弓发育和下颌骨分化起到至关重要的作用,检测到的两个突变极有可能与患者的临床表现高度相关.本研究发现了两个致病基因中未报道过的疑似致病突变,提出EDNRA基因缺陷同样可能与耳髁突综合征(ACS)表型相关,为研究人类下颌骨发育的致病因素和遗传机制提供了重要的病例和遗传学数据,进一步证明了EDN1-EDNRA-DLX信号通路在人类下颌骨发育过程中的重要作用.