蜡样芽孢杆菌ATCC14579毒力基因plcR缺失株的构建及其一般特性

蜡样芽孢杆菌是土壤中的优势菌,具有作为益生菌的潜在能力,同时它也是条件致病菌,能引起食物中毒等。蜡样芽孢杆菌的多种毒力因子受到多效性调控子(pleiotropic regulator,plcR)的调控,在其条件致病性作用中起着重要作用。真养产碱杆菌JMP34(Alcaligenes eutrophus)质粒上的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)单加氧酶(tfdA)基因可以降解2,4-D。本研究利用同源重组技术使tfdA基因置换掉蜡样芽孢杆菌的plcR基因,构建了蜡样芽孢杆菌ATCC14579突变株B.cereus△plcRΩtf-dA,并对其毒性、一般生理生化特性进行分析。研究结果表明,突变株B.cereus△plcRΩtfdA的毒性显著减弱;生理生化实验结果显示突变株与野生株并没有明显区别,且突变株并没有表现出tfdA酶活性。所有的结果表明plcR控制着蜡样芽孢杆菌ATCC14579的致病性,同时剔除plcR并不破坏其酶系统。本研究为今后构建蜡样芽孢杆菌工程菌提供了新的思路和依据。

高致病性2型猪链球菌plcR基因敲除株的构建及其相关生物学特性的研究

【目的】构建高致病性2型猪链球菌05ZYH33菌株plcR基因敲除株,通过比较突变株与野生株生物学特性的差异,研究plcR基因在2型猪链球菌致病过程中的作用。【方法】利用同源重组技术敲除plcR基因,多重交叉PCR及RT-PCR鉴定并测序验证。比较野生株与突变株基本生物学特性的差异,小鼠攻毒实验分析plcR基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】经RT-PCR证实05SSU0241与05SSU0242共转录,通过多重交叉PCR及RT-PCR证实成功构建plcR基因缺失突变株,基本生物学特性显示突变株的生长速率、菌落形态、溶血活性均无显著改变,小鼠致病性试验结果显示,野生株攻毒的小鼠死亡率为70%,突变株攻毒的小鼠死亡率为40%,毒力较野生株显著降低。【结论】plcR基因作为2型猪链球菌有毒株基因组中特有的外源基因,在细菌致病过程中具有重要作用。

人全长PLCγ1基因真核表达载体的构建及鉴定(英文)

目的构建人全长PLCγ1基因真核表达载体,以便进一步研究PLCγ1的作用及其机制。方法自行设计一对带有HindⅢ和NotⅠ酶切位点的引物,采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCγ1cDNA(3878bp),纯化后,经HindⅢ-NotⅠ酶切,插入真核表达载体pLNCX2中,构建重组质粒pLNCX2/PLCγ1。通过PCR,限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后,利用RT-PCR及Westernblotting转染后LoVo细胞中PLCγ1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经HindⅢ-NotⅠ酶切后,得到3878bp(PLCγ1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段,同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后,得到约1300bp及约8500bp两个片段,与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westernblot分析证实转染pLNCX2/PLCγ1的LoVo细胞中PLCγ1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCγ1基因真核表达载体pLNCX2/PLCγ1,为进一步研究PLCγ1的作用奠定了基础。

2型猪链球菌新毒力因子PlcR的发现

2型猪链球菌（SS2）是一种重要的人畜共患传染病病原体。SS2感染不仅可致猪急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡，并且可通过伤口和呼吸道等传播途径，导致人的感染发病和死亡。1998年和2005年在我国江苏“苏中”地区和四川资阳等市县人群中曾先后两次暴发大规模SS2感染人的事件。